(一)原理及基本装置
液相色谱中的柱色谱法又称柱层析法,既可以用比较复杂的装置,也可以用简单的设备。用一根适宜的柱子,一个洗脱装置,一个流量控制装置(蠕动泵),一个紫外检测仪和一个部分收集器就可以构成最基本的分离装置。色谱柱是整个过程的心脏,在使用时必须满足下述要求:
(1)柱底应有一凝胶的支持层,该支持层应保证溶液能从柱中自由流出。
(2)支持层下面的死体积要尽可能小。
(3)柱子的出口应有一个合适的接头与检测器和部分收集器相连。
(4)以玻璃管和塑料管较好。柱子的基本结构如图 6–1
早期,通过柱子的液体以重力输入为主,这时柱子入口高于出口,以产生静的水压差。但在洗脱期间,贮液容器中洗脱液液面的下降会降低流体压力,从而也降低了洗脱液通过柱子的流速。目前多使用蠕动泵来输送洗脱液(如图 6–1)。蠕动泵可以产生一个稳定的液体流速而被广泛地使用,它可以用于上样品,输送缓冲液,产生梯度洗脱方式。分离生物大分子时,液体流出后要尽快地进行检测,一般使用紫外检测仪。生物大分子一般在28Onm进行连续的检测(Trp+Tyr)或者在更灵敏的220或205nm(肽带)波长进行检测,最后使用收集器收集所需的组分。
由于部分新手刚接触过柱,需要系统地了解过柱的方法技巧,我把一个从事多年化学工作,有丰富实验经验的先生的过柱经验转载过来,希望对大家有用。(看了请及时回帖,谢谢~~)常说的过柱应该叫柱层析分离,也叫柱色......
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