普通PCR、实时荧光定量PCR和数字PCR对比分析（一）

提起 PCR，在生物及其相关行业内可谓如雷贯耳，无人不知无人不晓，其影响之深，应用之广可见一斑。

1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了聚合酶链反应（PCR），实现了在试管中模拟细胞内的 DNA 复制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。 耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行，随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循环仪，从此拉开了 PCR 大展拳脚的序幕。

根据 PCR 的发展进程，本文将对普通 PCR、实时荧光定量 PCR 和数字 PCR 这三代 PCR 进行分析，期望对 PCR 感兴趣的读者能从中有所收获。

普通 PCR

基本原理

PCR（聚合酶链式反应）是一种体外 DNA 扩增技术，是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经「高温变性—低温退火 —引物延伸」三步反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

PCR 反应体系举例

仪器与耗材

基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制。这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点，在此不再赘述。

结果检测

PCR 反应扩增出很高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性不太高，引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判，但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

应用

PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的 DNA，就能用 PCR 加以放大，进行比对。这也是「微量证据」的威力之所在。

实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 

基本原理

qPCR 技术是在反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团，随着 PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，导致荧光信号不断积累， 从而利用荧光信号的变化实时监测整个 PCR 进程。

根据 PCR 定量原理公式可推导出， 模板起始拷贝数的对数与阈值循环数呈线性关系，模板起始拷贝数越多，荧光信号达到阈值的循环数越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，根据荧光基团发出的荧光强度与 PCR 扩增产物的数量呈对应关系， 只要对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的 Ct 值，即可通过标准曲线计算未知样品的起始拷贝数。

Ct 值指 PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。相同模板进行 96 次扩增，终点处产物量不恒定，但 Ct 值却极具重现性。