PCR测序方法你知道几种？（二）

(2)测序引物同位素标记测序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5末端进行同位素标记。引物浓度:0.1~0.2mmol/L

非同位素标记测序引物:用荧光标记4种双脱氧核苷酸,可以进行以荧光为基础的双脱氧测序反应。

(3)DNA聚合酶应为无3→5外切活性的耐热DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

(4)测序反应缓冲液根据所用的聚合酶具体而定。

(5)放射性标记的dNTP根据所用的聚合酶具体而定

三、方法

(本操作方法是以同位素标记为基础的测序)

(1)标记引物取10~15pmol测序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶缓冲液(商品厂家提供),加水至反应体系50,混匀后37℃预热5min

加人1μ现稀释的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃继续孵育30min。

通过凝胶过滤柱除去未掺入的[yP]ATP

标记好的引物可在-70℃保存2周以上。

(2)制备dNTP/ ddNTP混合物在4个微量离心管中各加入一种dNTP/ ddNTP混合物2ul

(3)制备反应混合物取相应的DNA模板、标记的测序引物1~2pmol、3pl的10×测序反应缓冲液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至总体积20l,混匀。在该混合物中加入某些试剂,如DMSO、 Triton X-100、吐温20或NP40等,彻底混合均匀,可以提高序列梯度的质量。

(4)循环反应分别取反应混合物4团l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的热循环仪上进行循环反应。每次循环包括:94℃变性1min、40~60℃退火30s和72℃链延伸终止30s。循环次数:20~40次。

(5)终止反应体系循环结束后,在各管中加入4pl终止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),混匀。样品可在一70℃保存2~7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min

(6)电泳分离和序列判读每一泳道上样2~3pl,电泳。采用放射自显影方法进行序列判读标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2~3d曝光显影。

四、注意事项

①在标记引物过程中,为获得高比活的标记引物,反应体系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一个最佳水平

②确定最佳dNTP/dNTP比例非常关键,应采用产生低本底、高显影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。

③为了提高靠近引物(1~100个碱基范围内)的序列梯度的自显影强度,可以向测序反应体系中加人Mn2,提高DNA聚合酶对掺入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而当为了提高远离引物(200~400个碱基范围内)的序列梯带的自显影强度,则需要提高链延伸终止反应混合液中dNTP的含量,具体依所用聚合酶而定。

全自动DNA测序法 

随着科学技术的发展,DNA测序已从人工操作发展到用自动测序仪进行全自动测序,使得测序的准确度、样品序列判读长度和速度有了极大的提高。如今科研工作者只需准备好所需测序的样品,送至专业的测序公司用全自动DNA测序仪(如 Applied biosystems的377型全自动DNA测序仪)进行测序即可。本节简单介绍全自动DNA测序仪的特点,不对全自动测序仪的具体操作步骤和注意事项等做详细介绍。

全自动测序仪一般由:电泳系统,激光检测装置,软件,计算机和打印机等几部分组成。

全自动测序仪采用4种荧光染料标记核苷酸、在一个泳道测序的方法,有效地避免了因单一标记方法(如同位素标记)中4个泳道电泳时所造成的迁移率不同对测序准确度的影响。

由于可以采用两种荧光标记方法(标记dNTP法和标记引物5端法)、多种DNA聚合酶和测序试剂盒,使得测序DNA模板种类大大增加,如单链DNA、双链DNA和PCR产物等。

全自动测序仪可以采用激光激发,使得代表不同碱基信息的不同颜色荧光先经过光栅分光,经CCD摄像机同步成像,一次扫描可以检出多种荧光,使得测序速度高达200bp/h,一个样品一次可以测定700余个碱基。

在电泳技术方面,简化了灌胶技术,采用精确控温,提高了测序的精确度

应用多种软件,可以进行DNA片段大小和定量分析、遗传基因的组型分析、DNA亚克隆序列拼接、DNA和蛋白质序列比较等。

全自动测序仪可以使得一次测序样品数量大大增加,多达96个样品,极大地提高了工作效率。现在国内有许多公司进行全自动测序,只需要将克隆的菌株交给公司,一般在3~5d后即可得到结果,测序的长度在每个反应500~800bp左右。

应用 

PCR测序是对生物遗传信息的最终判定。随着各种基因组计划的开展,PCR测序工作在不断加强和完善,特别是全自动DNA测序仪的开发,为提前完成人类基因组计划奠定了基础。此外,在临床遗传病、传染性疾病和癌症的基因诊断、农业畜牧业的动植物育种、法医鉴定等领域上有广泛的应用前景。过去由于全自动DNA测序的仪器成本较高,手工的同位素标记的测序在国内曾经发挥过重要作用;但随着国内科研试验条件的改变,全自动DNA测序仪已在国内广泛应用于序列的测定,但全自动DNA测序仪广泛应用于突变的检测目前还受国内实验条件的限制。