高效液相色谱串联质谱法测定奶粉中的双氰胺

1. 引言

双氰胺又名二氰二氨，缩写DICY 或DCD。是氰胺的二聚体，也是胍的氰基衍生物。白色结晶粉末，可溶于水、醇、乙二醇和二甲基甲酰胺，几乎不溶于醚和苯。干燥时稳定。双氰胺化肥，双氰胺复合肥料可控制硝化菌的活动，使氮肥在土壤中的转化速度得到调节，减少氮的损失，提高肥料的使用效率。农民普遍会在牧场使用双氰胺，目的是防止硝酸盐等对人体有害的肥料副产品流入河流或湖泊。新西兰的奶牛养殖是采取放养的方式，如果草木干旱，奶农往往会使用一些肥料增强草木的抗旱性以及肥力，这就造成了污染。而由于新西兰国内注重环保，因此使用双氰胺对草木中的有害物质进行中和，这就导致了残留的药品流入奶牛体内，造成奶品的污染。2013年1 月25 日，新西兰牛奶中发现了有害物质—双氰胺。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

奶粉中双氰胺的LCMSMS 检测的难点在于：首先双氰胺本身的分子量很小，极性很大，一般的C18 柱保留不住，其次婴幼儿奶粉的基质非常复杂，含有大量糖类和蛋白质，必须有合适的前处理方法以获得更好的净化效果。本实验选用Thermo Scientific Syncronis HILIC色谱柱配合Hypercarb 净化柱，建立了双氰胺LCMSMS的检测方法，结果显示该方法具有灵敏度高，重现性较好等特点。

2. 实验部分

2.1 仪器与试剂：

TSQ Quantum Ultra 三重四极杆串联质谱仪（赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific 公司），配置有电喷雾电离源（ESI）；Dionex Ultimate 3000 RSLC 超高压液相色谱

标准品：双氰胺纯度大于98％，内标双氰胺-15N4 纯度为95％。用乙腈溶解并配制成1.0 mg/mL 标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC 色谱纯。

表1. 液相梯度

2.2 仪器方法：

2.2.1 液相条件：

色谱柱：Syncronis HILIC，100mm×2.1mm，5μm；

梯度洗脱程序见表1，其中A 为0.5mM NH4Ac（pH=4.0）水溶液，B 为乙腈。进样量10μL.

2.2.2 质谱条件：

电喷雾电离源（ESI），正离子模式；选择反应监控（SRM）扫描模式，喷雾电压：3000V；气化器温度350℃，离子传输管温度：350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为30arb, 辅助气为8arb，氩气用作碰撞气, 碰撞压力为1.5mTorr; 选择反应监测（SRM），离子对见表2。

表2. 化合物离子对信息

3 结果分析

3.1 灵敏度：

经实验测定，双氰胺的LOD 为0.25ng.mL-1，信噪比为20，提取离子流图见图1。

图1. 双氰胺最低检测限图

3.2 线性范围

采用上述仪器方法进行测定， 双氰胺在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 呈现良好的线性相关性，线性相关系数为0.9998， 浓度水平分别为：0.5ng.mL-1、1ng.mL-1、5ng.mL-1、10 ng.mL-1、50ng.mL-1、 100ng.mL-1，内标双氰胺-15N4浓度为5ng.mL-1，线性方程见图2。

图2. 线性方程图

3.3 精密度

对1ng.mL-1 的双氰胺，采用上述仪器方法，连续进样7针，计算RSD 值。结果为1.19%，离子流图如图3。

图3. 平行进样7 针的色谱图

3.4 奶粉样品分析

取某市售婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验。奶粉的前处理方法如下：称奶粉基质样品2.000g，加10mL 1% 的甲酸/ 水提取液，涡旋震荡提取5min，超声萃取10min；冷冻离心机6000R/min，离心10min，取上清液5mL 到小离心管中，14000R/min 离心10min，上清液全部过净化柱（3cc,200mg/Hypercarb），控制流速1mL/min，用10mL 超纯水清洗柱子；用甲醇/ 乙腈（4/6）洗脱，接取洗脱液氮气吹干（40℃），用1mL（乙腈/ 水，9 : 1）定容，0.22 微米有机滤膜过滤，上机检测。结果表明，空白基质在双氰胺及内标双氰胺-15N4 的出峰位置没有干扰，添加5ng.mL-1 的色谱图如图4，该图中上方为基质添加，下方为基质空白。

图4. 基质添加及空白基质色谱图

结论：

TSQ Quantum Ultra 三重四极杆液质联用系统检测奶粉中双氰胺具有灵敏度高、特异性好的优点，检测定量限可以做到0.25ng.mL-1。并且该方法具有良好的线性范围与精密度， 在0.5ng.mL-1-100ng.mL-1 的线性相关系数为0.9998，重复进样7 针1ng.mL-1 的双氰胺的RSD 值为1.19%。使用Hypercarb 净化柱能很好的处理奶粉样品，空白基质没有干扰，证明该方法检测双氰胺具有很好的适用性。