包涵体蛋白的纯化和复性实验过程（一）

一．菌体的收集和破碎

用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）

重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

二．包涵体的处理

洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）

2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）

三．目的蛋白的纯化

亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶 性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点：首先，由于只有6个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在变性条件下纯 化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点，但 此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

融合蛋白的表达和纯化过程：

1.挑单菌落于3-5 ml 2YT或LB 培养中，37℃过夜培养。

2.按1:100的比例取过夜培养液转接。37℃扩大培养至OD 0.5左右。

3.加入IPTG终浓度0.2～0.4 mM/L。 37℃摇床培养4～6h。

4.12000g离心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer，细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。或4×PBS重悬细胞。

5.超声波破碎：占空比50％，超声15s，停15s，10～20min。破碎后的匀浆在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

6.洗涤包涵体：2M尿素在50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，10% Triton X-100中洗涤。洗涤2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，10% TritonX-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。

7. 过Ni柱：

Ni2＋亲和层析柱纯化

包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni2＋沉淀；5×柱体积的Charge Buffer充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽游离的Ni2＋；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤，至检出无蛋白，并收集流出液，用于12％SDS-PAGE电泳检测；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1 mL，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；10×柱体积的Binding Buffer平衡。此时，即可用于纯化同种蛋白，不需重新充电。

纯化操作完成后，加5×柱体积的Strip Buffer洗涤，去尽Ni2＋；10×柱体积的三蒸水洗涤去尽EDTA；加5×柱体积的0.5 mol/L NaOH，静置0.5-2 h，去沉淀的蛋白质；三蒸水洗涤，至流出液的pH值为7.0；20％乙醇洗涤，再加适量20％乙醇，于4℃保存。