激光扫描影像系统在3D肿瘤球体或干细胞克隆球体快速检测和分析中的应用
发现新的抗癌药物的研究目前正面临着重要的挑战，因为在临床前研究显示有效果的化合物只有5％的能继续被开发，成为获得许可的药物。传统的2D细胞培养模型在药物发现过程的早期阶段被用于评估候选药物，然而，有越来越多的证据表明，在二维单层生长的细胞并不能准确地反映肿瘤的生物学复杂性。
对兼容高通量筛选的更好的体外模型的需求引导了3D细胞培养模型的发展，尤其是多细胞微球，其将保留肿瘤的许多形态学和遗传性状。在体外实验中，3D培养模型被广泛地认为相比2D形式的培养系统是更加具有生理相关性的模型。3D模型更加准确地反映了体内微环境中的复杂性，并被用于许多的研究领域，比如肿瘤学[1]，肝脏毒性[2]，神经生物学[3]，胰腺研究[4]，肾脏学[5]，以及干细胞研究[6]。这些研究颠覆了我们对体外培养中以及体内的细胞行为学的认识。然而，由于细胞培养技术的限制，以3D培养系统进行高通量筛选却发展地非常缓慢。技术瓶颈包括实验的异质性、低通量、难以实现自动化以及昂贵的成本。
在这里，我们描述通过两种方法进行3D培养的细胞球体检测：1）在超低附着板中；2）在半固体琼脂上。这两种方法都可在96和384孔微孔板形式上进行。
我们随后用Acumen hci激光扫描技术进行快速的整板图像采集（5分钟/块），给出一系列参数，例如球体的数量、面积和体积。Acumen hci是适于对微球体进行高内涵分析的完美系统，它独有的全孔扫描能力可一次采集单孔中不同位置所有微球体的信息，而具有一定景深的扫描镜使得可对孔中处于各层的球体也一次捕获，对单个球体体积进行统计而无需对其进行Z层断层扫描，多次采集数据。
方法：
A：在超低粘附板中形成肿瘤微球体
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Corining的超低粘附板，采用不透明的壁和清晰、圆形的孔底。专有的超低细胞粘附涂层，具有亲水性、生物惰性的和不可降解的特性，通过共价连接到孔底部的内表面上。这种对培养孔底部独特的设计，使3D细胞球体培养物可高度可重复地生长。不透明的侧壁和专有板底网格形式的设计大大降低了荧光、冷光背景和孔与孔之间的串扰。在孔中，球状体可以生成，培养，并进行荧光或者冷光信号的检测，而无需将球状体转移。目前，Corning超低粘附板具有96孔和384孔板形式，这两种板型都很方便进行自动化。
a) 将悬浮于完全培养基中的肝癌细胞株HepG2的单细胞铺板于Corning超低粘附板中（#4520&3830），铺板密度为96孔板每孔200μl含有300个细胞，384孔板中每孔50μl含有300个细胞 b) 在24小时内，悬浮的细胞将组装成单个3D微球，沉淀在细胞中央，如右图Figure1A所示 c) 72小时后，将50%的培养基更换成含有2倍浓度的Doxorubicin（阿霉素）的新鲜培养基，更换后终浓度为316pM~3.16μM d) 形成的微球体继续培养6天 |
Figure 1A |
B：在软琼脂中形成肿瘤微球体
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96孔板 |
384孔板 |
Figure 1B |
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基底层（含0.6%琼脂的培养基） |
25μl |
10μl |
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细胞层（含0.4%琼脂的单细胞悬液） |
50μl含有500个细胞 |
20μl含有150个细胞 |
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培养基覆盖层 |
75μl |
30μl |
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a) 按照以上体系进行软琼脂的配制 b) 将含有单细胞的软琼脂培养于37度培养箱 c) 24小时后，将5μl的Doxorubicin（阿霉素）加入孔中，终浓度为1nM~1μM d) 继续培养微球体4天，3天更换一次含有阿霉素的覆盖层培养基 |
C：染色和图像采集
| a) 在含有细胞微球的孔中加入染料Calcein-AM（终浓度为5μM）对两种方法形成的肿瘤微球体进行染色，染料加入后在37度孵育1小时 b) 板子随后用Acumen进行图像采集（每板的图像采集和数据输出需要5分钟） c) 数据是在线分析的，在扫描图像的同时即获得了，得出的报告含有球体的数量、面积和体积、荧光强度等等信息 |
Figure 1C |
