发布时间:2020-06-08 12:41 原文链接: RNA实验和方案新手必读(三)

核糖核酸酶(RNase)是非常稳定、活跃的酶,它们通常不需要辅因子就能发挥功能。由于核糖核酸酶难以失活,并且很小的量就足以破坏RNA分子,因此在没有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情况下,不要使用任何塑料或者玻璃器皿。处理RNA时应非常小心,以避免在纯化的过程中或者纯化之后,将核糖核酸酶无意的引入到RNA样品中。为了创造并维持没有核糖核酸酶的环境,在预处理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液处理RNA时,一定要采取以下预防措施。

常规操作

处理RNA时,一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌,是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染,在操纵试剂以及RNA样品的时候,一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套(PVC手套)。可能的情况下,要经常更换手套,并将试管处于关闭状态。当用移液管吸取溶液用于下游应用时,要将纯化过的RNA放在冰上。

为了去除工作台表面、非一次性塑料器皿和实验室器械(比如,移液管和电泳槽)上的核糖核酸酶污染,推荐使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常见的实验室试剂去除核糖核酸酶的污染。为了去除塑料器皿上的污染,使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗涤,然后使用去RNase的水洗涤;如果塑料器皿具有耐氯仿性,则可用氯仿洗涤。为了去除电泳槽的污染,可使用去污剂清洁(比如,0.5%的SDS),使用去RNase的水洗涤,然后用乙醇洗涤(如果电泳槽具有耐乙醇性),之后晾干。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套,以及具有护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

一次性塑料耗材

在处理RNA的时候,推荐使用无菌的,一次性的聚丙烯管。这些试管通常没有核糖核酸酶,因此不需要预处理使核糖核酸酶失活。

非一次性的塑料耗材

非一次性的塑料耗材在使用之前应该进行处理,以确保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材应该严格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗涤,然后用去RNase的水洗涤。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗涤,以使核糖核酸酶失活。

玻璃器皿

玻璃器皿在使用之前,应该进行处理,以确保其不含有核糖核酸酶。用于处理RNA的玻璃器皿在使用之前,应该使用去污剂清洁,严格的洗涤,并在240°C的烘箱中烘烤至少4小时(如果更方便的话,可以过夜)。也可以使用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC(0.1%的水溶液)充满玻璃器皿,在37°C的条件下过夜(12小时),然后使用高压釜处理或者加热到100°C 15分钟,以去除剩余的DEPC。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

电泳槽

电泳槽应使用去污剂(比如,0.5%的SDS)清洁,严格的用去RNase的水洗涤,然后使用乙醇洗涤,之后晾干。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商处提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

重要:一些电泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性,需要仔细查阅厂商说明书。

溶液

溶液(水或者其它溶液)应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂,它通过共价修饰RNase发挥作用。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。