TaqMan miRNA的检测能力不同，是依据采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e
5个合成miRNA来检测低至一个核苷酸（图7）。每个miRNA的检测对应每个miRNA。相对探测效率是通过计完全匹配和不匹配的目标CT之间的差异，假设完美匹配的效率为100％。观察非特异性信号处在非常低的水平，从零到0.3％，对于miRNA有2-3不匹配，0.1-3.7％的单核苷酸不同。许多交叉反应，是由RT反应反应中G-T的错配导致的。如果miRNA之间出现超过三个不匹配，会有针对性的miRNA检测。
我们比较歧视的TaqMan miRNA的检测能力的不同，以解决杂交分析为基础的检测（图8）。在我们的手中，杂交方法可以很好地区分let-7a和let-7b。然而，在let-7a, let-7c 和 let-7d之间，几乎没有区别，而是由1–3 nt区分。
我们推测，茎环引物可能会比线性引物提供更好的RT效率和特异性。依据茎环的堆放可能加强RNA-DNA的热稳定性。此外，与传统的线性RT引物，茎环的空间约束可能会提高检测的特异性。我们比较的茎环和线性RT引物合成miRNA
let-7a的灵敏度和特异性(图
9)。我们观察到了茎环RT几个优势。首先，在合成let-7A目标时，线性和茎环RT方法CT值有7个数量级不同，表明茎环RT的效率高出至少100倍。其次，茎环RT在区分miRNA之间不同时，是基于ΔCT值两个原则的不同。最后，依据7个数量级ΔCT，对于区分成熟的miRNA和其前体，茎环RT至少好100倍。
讨论
由于miRNA的发现，这些基因家族的特征的显著进展已经描绘了基因调控中miRNA功能的机制。因此，识别miRNA的生物标记特定的组织类型或疾病状态的广泛的研究已经开始。这些研究将会受益于miRNA准确识别和量化方法。
当前检测和量化miR-NAs的方法主要基于克隆，Northern杂交，或引物延伸。尽管芯片可以提高miRNA谱的产量，该方法在灵敏度和特异性方面有着是相对的局限性。对于miRNA的定量，灵敏度低已成为一个的问题，因为很难放大这些短的RNA目标片段。此外，特异性低，可能会导致密切相关的miRNA、前体和基因组序列的错误的积极信号。最近，已报道了针对miRNA量化的修改后的侵袭物检测。然而，侵袭物检测特异性和敏感性有限，每检测至少需要50
ng总RNA，或1000裂解细胞。
实时PCR是基因表达的定量的金标准。对于科学家来说，设计常规PCR，检测平均22个核苷酸长度的miRNA，一直是一种长期挑战来。我们开发了一种新的机制来设计TaqManPCR反应检测，用超过现有的常规检测方法的优越的性能来特异量化miRNA的表达水平。我们设计和验证检测了222个人的miRNA。这些分析相结合了PCR技术精湛的灵敏度，实时监控动态范围和TaqMan方法报道，以增加特异性。在我们的手中，与成熟miRNA相比，miRNA前体的效果至少差2000倍。由于对于前体或基因组DNA这些检测是不敏感的，我们可以直接添加热处理细胞检测，消除了样品制备的需要。对于成熟的miRNA及其前体的检测的需要，可用传统的TaqMan分析法来特异地检测前体。
我们观察到由于碱基堆积和空间约束的茎环结构，茎环RT引物比传统的线性引物有更好的特异性和敏感性（图9）。碱基堆积性可以提高热稳定性，并延长有效的RT引物/ RNA双螺旋，可能需要相对较短的逆转录引物来提高RT的有效性。茎环结构的空间限制，可以防止结合基因组双链DNA。因此，RNA样品制备为消除TaqMan miRNA的需要。潜在的茎环RT引物可以为多重RT反应和小分子RNA克隆可能提供更好的效率和特异性。
对于整体miRNA谱有一个敏感的、特异地增加需求。有效高调的miRNA的能力可能会导致miRNA的生物标志物疾病或组织特异性的发现，以及有助于理解miRNA如何调节干细胞分化。我们的茎环RT-PCR方法，可以为这些研究提供了一个切实可行的解决办法。我们目前正在开发多重办法，要进一步提高这种方法的效用。