四．CRISPR/Cas9技术与新一代测序技术的联用
革命性技术总是发展迅速、应用广泛的。作为另一项革命性的生命科学研究技术，DNA新一代测序技术在近五、六年得到快速发展和推广。它已经用于生命科学相关领域的许多方面。同样地，也可以用在CRISPR/Cas9相关的研究中。两者之间的应用领域有许多交叉或重合。
1．高通量测序可用于检验CRISPR/Cas9基因组编辑的结果，以及进行脱靶效应的分析
编码Cas9和sgRNA的片段通过质粒或其它途径转染进细胞后，Cas9在特异的位点对目标基因组进行切割，引起DNA双链断裂 （double-strand break, DSB），通过非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）或同源重组（homologous recombination, HR），产生DNA的插入或删除（indel），或者依赖于含有特异突变的同源模板，进行目的位点的定向改造。基因组编辑的结果需要确认。对于目标位点或计算机预测的脱靶位点，除了用核酸酶进行电泳分析检测外，还可以用DNA测序方法确认是否有变。当需要检测的样品较少或靶位点较少时，可以采用Sanger测序。当样品或靶位点较多时，适合采用高通量测序。这需要用测序引物对靶位点进行PCR扩增，然后对扩增子（amplicon）测序。几种当前常用的高通量测序平台均被不同的实验室采用过。因为不同的高通量测序平台测序的最大读长不一样，需要注意扩增产物的长度和测序引物的位置。曾有报道，读长较长的SMRT DNA 测序对于基因组编辑的结果评估也很有意义。
CRISPR/Cas9的特异性是人们对该系统关心的一个问题。 它被关注后不久有报道提出了CRISPR/Cas9的脱靶问题。脱靶效应与诸多因素有关，如sgRNA自身的特征、浓度及其与Cas9的相对量多少等等。人们通过改造这个系统的元件或采用不同的策略增加基因组编辑的特异性。尽管一些文献报道，对人类iPSC进行CRISPR/Cas9编辑具有很高的特异性，人多能干细胞中的脱靶突变发生率很低，但基因组编辑的安全性仍然是人们担心的一个问题，尤其在基因治疗领域。全基因组测序（whole genome sequencing ）可以对整个基因组进行单碱基分辨率的检测，当CRISPR/Cas9用于基因治疗等对安全性要求较高的领域时，有必要采用这一方法检测基因组编辑的效果。当前已有不少对CRISPR/Cas9编辑后的基因组进行全测序的实例。
对于基因组比较大的生物体来说，全基因组测序花费毕竟是高昂的。那么，此时如何了解CRISPR/Cas9 在某种生物或某类型的细胞上是否容易脱靶呢？对于目标区域进行富集，然后对富集的片段进行高通量测序，是一种策略。对于DSB区域的富集与检测，曾报道过BLESS 法（Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and next generation Sequencing ）。最近，J. Keith Joung 领导的小组报道了一种检测方法，称为Guide-seq （Genome-wide, Unbiased Identification of DSBs Enabled by sequencing）。这种方法的过程是，使活体细胞吸收双链寡核苷酸（double-stranded oligodeoxynucleotides，dsODN）标签并整合进基因组断裂位点，抽提基因组DNA，进行随机打断和末端修复加高通量测序接头等操作，然后依据dsODN的专有序列进行PCR扩增，富集出包含dsODN的片段，对收获的片段进行高通量测序，分析Cas9的切割位点（过程示意见图3）。它适合临床前对所采用的CRISPR/Cas9在某类细胞中的应用风险进行评估。
图3. Guide-seq 的流程。摘自Tsai SQ等， GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2014 Dec 16.
在进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析时，有些研究者采用了染色质免疫共沉淀结合高通量测序的方法（chromatin immunoprecipitation and high throughput genome sequencing, ChIP-seq)，通过特异性的抗体捕获Cas9或其衍生物结合的DNA片段。这也是一种富集测序策略。
2． CRISPR/Cas9技术与高通量测序结合用于研究基因的功能
Cas9包含两个活性区域，即RuvC 和 HNH 结构域，各负责切割一条DNA单链。当只有一个结构域引入突变时，Cas9可被改造成为切口酶（nickase）nCas9。nCas9与两条不同的sgRNA联用可用于较大片段的置换，也可增强编辑的特异性；当两个结构域同时引入突变时，Cas9内切活性丧失，成为dCas9（dead Cas9）， dCas9仍能与靶区域结合。dCas9 可以用来开启或关闭某些基因的表达。它与目的基因启动子区域或编码区段时，可能由于空间位阻效应阻挡了转录因子或 RNA 聚合酶与 DNA 的结合，从而抑制转录。将dCas9与转录调控因子如KRAB的抑制区融合，可抑制靶基因，这就是CRISPRi（CRISPR interference）；dCas9也可与VP64的激活区结合，激活靶基因。dCas9的这种特异性调控功能，与 RNA-seq相结合，可以用于许多基因功能相关的研究。CRISPRi用于真核生物时甚至比RNAi还具有优势。
不通过RNA-seq这种方法，CRISPR/Cas9技术与高通量DNA测序结合也可进行功能基因组学研究。国内外一些研究者已经通过CRISPR/Cas9技术建立可能与某类功能相关的突变体库，通过功能性筛选和富集、PCR扩增以及深度测序分析，确认与这类功能相关的基因。
3． 新一代测序的结果，为CRISPR/Cas9技术的应用提供了对象
新一代测序技术既可以在全基因组或全转录组范围内筛选出基因或其转录产物的变化，也可以在某个局部范围（如外显子组内）考察基因的变异。这项技术适合在其它线索很少的情况下（如基因位置信息）筛选出与某些功能相关的、变异的目标基因。这些目标基因的具体功能可以用CRISPR/Cas9技术进行研究。
例如，CRISPR/Cas9技术与高通量测序技术相结合，在药物开发中可用于快速发现药物的靶标并进行有效、直观的验证。这对探究药物的药理、毒理或细胞的抗药机理非常有意义。它是一种可用于反向遗传学的技术，可以从另一角度验证正向遗传学的结果。先用药物处理细胞，选出药物抗性克隆，对这些克隆进行新一代测序，找出候选的基因突变，这些基因的产物可能是药物的靶标。如何确认某一（或某些）候选基因突变导致药物抗性？研究者们采用CRISPR/Cas9技术突变这一（或这些）基因，观察细胞是否出现抗性。在这类研究中，用新一代测序大范围内快速发现候选的基因突变，非常有必要。有些研究者通过对基因组测序发现侯选的突变；有人则为了兼顾研究基因表达情况，采用了转录组测序的方法进行突变检测。
再如，对于肿瘤组织与癌旁组织进行转录组测序，选出某些差异基因，再用CRISPR/Cas9 系统验证这些基因的功能，也是对肿瘤相关基因进行研究的一条策略。
总之，新一代测序可以为许多进一步的研究（包括利用CRISPR/Cas9技术的研究）找到切入点。
4． 新一代测序可以用于研究自然界存在的更多物种的CRISPR/Cas 系统
CRISPR/Cas 是一类基于基因的功能系统，它自身也可以用新一代测序技术加以研究。前文已提到，自然存在的CRISPR/Cas 系统有多种类型，CRISPR/Cas9只是其中的一类。深入研究和了解不同类型的CRISPR/Cas 对于充分认识和利用这类系统很有必要。譬如，利用RNA-seq 技术，有人在不同的微生物发现新的CRISPR位点；有人则用RNA-seq 探索了CRISPR RNA 的加工（processing）和调节机制。也有作者利用高通量测序技术研究了CRISPR位点间隔区（spacer）的获取机制。
五．结语
新一代测序技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术，是进入二十一世纪十几年来先后发展出来的两项影响较大的遗传学研究技术。像PCR技术一样，两者已经大大推动了生命科学相关领域的研究。在科研中将两者有效地联用，不但可以带来事半功倍的效果，也有助于解决许多悬而未决的技术问题。