冰片对长时连续作业大鼠觉醒能力及认知功能的影响

摘要 目的: 探讨冰片对长时连续作业大鼠觉醒能力和认知功能损害的干预作用。方法: 首先采取跑台作业方法建立大鼠长时连续作业模型, 将模型大鼠分为跑台冰片组和跑台对照组, 另设未跑台对照组。随后观察冰片对长时连续作业大鼠活动- 静止行为、 觉醒时间以及穿梭箱主动回避反应的影响。 结果: 3 组纳入测试的大鼠各为 6 只。 结果显示给予 0.4 g /kg 冰片(经胃灌饲)可增加大鼠长时连续作业后的自主活动量(每分钟活动次数未跑台对照组为 54.1± 5.4, 跑台对照组为 15.5± 8.3, 跑台冰片组为 26.8± 7.8, 3 组之间两两比较, P 均<0.05)和觉醒时间(未跑台对照组为 639 min± 46 min, 跑台对照组为 411 min± 36 min,跑台冰片组为 501 min± 52 min, 3 组之间两两比较, P 均<0.05) , 同时还可改善长时连续作业大鼠的认知功能(穿梭箱主动回避作为测试反应时间, 未跑台对照组为 5.63 s± 1.01 s, 跑台对照组为 6.85 s± 1.24 s, 跑台冰片组为 6.26 s± 0.96 s, 3 组之间两两比较, P 均<0.05)。结论: 冰片可在一定程度上逆转长时连续作业对大鼠觉醒能力和认知功能的损害作用。 

关键词 冰片;大鼠长时连续作业;觉醒能力;认知功能 

长时连续作业对觉醒能力和认知功能有显著的损害作用。当前，这一问题的研究已逐渐引起国内外的广泛重视 [ 1,2]。迄今已研发和筛选出多种抗疲劳药物及神经兴奋剂，包括咖啡茵、可可碱、***（安非他明）和莫达非尼等。尽管这些药物早已得到应用，但其成瘾性和选择性差等缺点在很大程度上限制了其广泛使用。因此，寻找速效、后效应小以及成瘾性小、高选择性的精神兴奋剂必然会成为今后研究的重点[ 3,4]。中医药作为祖国医学宝库，在筛选理想的精神兴奋药物方面有着广阔的前景，例如牛黄、冰片、麝香、石菖蒲以及苏合香等芳香开窍药在临床实践中已有大量的应用[ 5,6]。冰片（又称龙脑）为常用芳香开窍中药之一，系龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品，或樟脑、松节油等经化学合成加工制成品。天然冰片主要化学成分为龙脑，尚含有大量龙脑的差向异构体异龙脑。中医认为冰片味辛苦、微寒、归心、脾、肺经，有开窍醒神、通诸窍等作用。对冰片的药效学、药代动力学及安全性等方面的研究表明，冰片除具有抗炎、抗菌、抗生育以及止痛等作用外，还可以缩短戊巴比妥钠持续睡眠时间，表现出醒脑和兴奋作用[ 7]；而且冰片还能延长小鼠耐缺氧存活时间[ 8]。另外，含有冰片的一些方剂，如安宫牛黄丸和复方丹参片等，已广泛用于神经内科，对于治疗昏迷、改善老年性痴呆患者的认知功能有明显疗效[ 9～11]。综上所述，我们有理由推测，冰片可能具有改善长时连续作业工作状态，以实现提升觉醒能力和认知功能的作用。为了探明冰片是否具有逆转或防治长时连续作业不利因素的作用，我们建立了长时连续作业大鼠模型，观察连续作业结束后给予冰片对大鼠随后 12 h 觉醒能力和认知功能的影响。 

1 材料和方法 

1.1 主要试剂和仪器 

戊巴比妥，天然冰片，液体石蜡；实验前取适量冰片结晶体，研钵研细，用液体石蜡配成 8%冰片石蜡油混悬液。分析天平，立体定向仪，多道生理信号采集处理系统，小动物跑台，穿梭箱主动回避行为测试装置，视频监视器，视频捕捉及分析软件。 

1.2 实验动物及分组 

健康成年雄性SPF级SD大鼠，体重( 250±10)g。所有大鼠均在设定的室内环境中至少适应 2周。室内环境：明-暗周期 12 h: 12 h（7: 00 开始给予光照），自然光照，温度 24~26 ℃。动物自由饮水、摄食。实验共分为 3 组，各组 6 只大鼠：①未跑台对照组：不进行跑台作业，置于鼠笼中自由活动，进食、饮水时间及其他处理因素与作业组一致；②跑台冰片组：进行长时连续跑台作业，作业结束后给予 0. 4 g/ kg冰片石蜡油溶液；③跑台石蜡油组：在进行长时连续跑台作业结束后给予与跑台冰片组同体积的石蜡油溶液。 

1.3 脑电电极安放及皮层脑电( electrocorticogram,ECOG)记录具体方法参照以往文献[ 12]进行。戊巴比妥钠麻醉（30 m g/ kg，腹腔注射）后，大鼠头部固定于立体定向仪框架上。将铜质螺丝钉分别通过颅骨埋入额叶和顶叶皮层，以接触到硬脑膜为度，用于记录皮层脑电活动。脑电极以牙科水泥固定于颅骨上。手术结束后，动物在上述室内环境中恢复 2 周。采用 R M 6240 多道生理信号采集处理系统进行脑电记录。 

1.4 长时连续作业方法 

长时连续作业在小动物跑台上进行，采用我们已建立的（18+6 h）×2 作业模式[ 12]。作业过程包括 20 m i n 作业 +20 m i n 作业暂停，作业和作业暂停视为 1 个周期。跑台参数设定：作业时坡度0°，速度 15 m / m i n；作业暂停时坡度 0°，速度 7m / m i n。作业暂停过程中，跑台速度较为缓慢，由于跑道长约 1 m ，则动物每次最多可有 9 s的运动暂停时间，此时运动因素影响作用降到最低，而只是达到睡眠剥夺的目的，因此我们把此过程称为作业暂停。整个过程连续给予电刺激，刺激强度20 V，频率 60 H z，一旦动物进入电刺激区则会受到电击，迫使其继续运动。每 4 个周期后将动物置于笼中给予自由活动，自由摄食、饮水 15m i n。作业前所有动物均未进行过跑台适应训练。本实验采用连续 48 h（两个昼夜周期）作业模式，每个昼夜周期包括作业阶段和休息阶段两个部分。（1）跑台作业阶段： 第 1 天19: 00至第 2 天13: 00，进行跑台作业训练；（2）休息阶段：第 2 天13: 00～ 19: 00，大鼠在鼠笼中自由活动，自由摄食、饮水。 

1.5 给药方法 

参照文献剂量[ 9]， 冰片所用剂量为 0. 4 g /kg，通过自制的灌胃管给药。给药均在跑台作业结束（13: 00） 后 5. 5 h （18: 30）进行，在 30 m i n内完成。 

1.6 觉醒能力及认知功能评价 

通过 3 项指标来评价动物的觉醒能力和认知功能，即大鼠觉醒期间（19: 00～ 7: 00）的行为状态分布模式、觉醒时间以及穿梭箱主动回避行为测试。 

1.7 数据分析与统计 

计量资料以 x± s 表示，采用 SPSS10. 0 软件进行单因素方差分析（A N O V A） 。 

2 结果 

2.1 冰片对长时连续作业大鼠活动- 静止行为活动分布的影响本实验通过视频监视器对大鼠自主活动进行连续观察和记录，记录结果通过视频分析系统（R M V I D EO）进行分析，该系统把大鼠自主活动简化为活动和静止两种状态，自主活动量以平均每分钟的活动次数计算。结果如表 1 所示，未跑台对照组在整个夜间（19: 00- 7: 00）主要处于活动状态；跑台冰片组活动明显多于跑台石蜡油组（P<0. 05） ，但仍比未跑台对照组少（P <0. 01）2.2 冰片对长时连续作业大鼠觉醒时间的影响动物的睡眠、觉醒状态主要通过 EC O G 进行判断： δ波（0. 25～ 4 H z）通常可作为慢波睡眠的判定指标[13]。觉醒时间测试结果：未跑台对照组为（639± 46）m i n，跑台石蜡油组为（411± 36）m i n，跑台冰片组为（501± 52）m i n；3 组间两两比较，差异均有统计学意义（P < 0. 05） 。 

2.3 冰片对长时连续作业大鼠穿梭箱主动回避反应的影响给药后 3 组大鼠分别进行穿梭箱主动回避行为测试，测试均在 21: 00 进行。各组大鼠反应时间：未跑台对照组为（5. 63 ± 1. 01）s， 跑台石蜡组为（6. 85 ±1. 24）s，跑台冰片组为（6. 26 ±0. 96）s；3 组之间两两比较，差异均有统计学意义 （P <0. 05） 。 

3 讨论 

长时连续作业对机体各个系统以及各种正常功能产生复杂影响，主要表现为觉醒能力的下降（即觉醒不良，ar ousaldef i ci t）和认知功能的受损[13～ 16]，即工作状态受损。因此，目前对长时连续作业不利影响防护措施的研究主要是集中于探索改善觉醒状态与恢复认知功能。大量文献已经表明，目前作业过程中作业能力下降的防治措施主要包括两方面：非药物干预和药物干预[2～5]。中医认为芳香开窍药（如牛黄、冰片、麝香、石菖蒲以及苏合香等）具有通关开窍、启闭醒神的作用，用于治疗闭证。现代医学研究表明，某些芳香开窍药具有兴奋神经系统，改善工作状态以及减少睡眠等作用[6～11]。例如，小剂量麝香可缩短异戊巴比妥钠诱导的睡眠时间；麝香水剂给清醒兔静脉注射，首先引起大脑皮层兴奋，表现为脑电去同步化，随后脑电出现高压复合波群，但行为上一直保持警惕状态，毫无困倦和睡眠倾向，并未出现痉挛、抽搐[17, 18]。又如，安宫牛黄丸可以广泛促进 c- f os基因在脑干、丘脑以及皮层相关觉醒脑区的表达，提示该药可能通过激活这些脑区从而达到促进清醒的作用[19]。文献中对单味冰片的醒脑和兴奋作用已有报道[9]。在此基础上，我们观察了冰片对长时连续作业大鼠觉醒能力及认知功能的影响。实验中，我们首先通过跑台作业方式建立连续作业大鼠模型，在作业过程结束后灌胃给予适量冰片，结果显示，冰片在一定程度上可以恢复长时连续作业大鼠的活动能力，增加觉醒时间，同时对认知功能也有改善作用。需要说明的是，本实验中的冰片给药剂量（0. 4 g/ kg）依据了既往报道[9]，该文献中所用实验动物为小鼠，而本实验中采用的是大鼠，但二者的结论是一致的，即冰片在该剂量下具有明显的促觉醒效应。另一方面，有文献证实，冰片可以改变下丘脑去甲肾上腺素、多巴胺、组胺以及 5- 羟色胺的含量[20]，而下丘脑的这些递质又与机体觉醒状态的发生和维持密切相关，因此我们推测，冰片对长时连续作业大鼠觉醒能力和认知功能的影响可能涉及上述递质水平的变化。这一推测是否成立还需要实验证明。尽管我们的研究初步揭示了冰片对长时连续作业的不利影响可起到一定的干预作用，但其作用机理以及冰片的药代动力学、药效学和副反应等问题还需要更多的实验探明。此外，其他芳香开窍药是否同样可以对长时连续作业所引起的不利影响产生干预作用，亦有待进一步研究。