通过温度内标提高高分辨熔解曲线中纯合子检测...（一）

通过温度内标提高高分辨熔解曲线中纯合子检测的灵敏度

摘要

应用高分辨率熔解曲线技术进行基因分型不仅简单而且有效。基于熔解曲线的分析方法中，探针法是进行基因分型的金标准，能够全面的检测匹配的目的等位基因。小片段扩增法是一种不需要设计探针进行基因分型的方法。由于异源双链的存在，杂合子很容易检测，而这很大程度上改变熔解转化的峰形。纯合子基因分型中G/C或A/T的改变是最难检测的，因为它们的等位基因有相似的Tm值。那些称为中性纯合子的碱基对使用小片段法是很难区分。此外，纯合子难区分也受样品与样品间温度的变化，缓冲液和体积的限制。无论多么精确的仪器，相关的变化可能是显著的，所以需要一种方法来减少这种变化并且改善小片段基因分型。而使用特异性内标就可以克服这些限制。

背景

人工合成的寡核苷酸内标和互补序列包含相同的分子浓度。在内标存在的情况下，使用普通96孔板PCR仪，并添加LC Green® Plus染料进行PCR反应。PCR反应完成后将PCR产物放入Lightsanner仪器，在55℃到97℃进行熔解曲线分析。内标的溶解识别通过每个样品的荧光数据进行校准。基因型通过测序进行验证。通过测量每个样品组相应的基因型的Tm值峰间的距离来估算校正前后的纯合基因型检测的错误率。当样品的Tm值与错误组的Tm值接近时，错误将被检测到。

结果

通过使用不同微孔板和PCR模板验证，使用温度内标校准后，纯和基因型在中性单核苷酸多态性碱基对检测的灵敏度提高了90%到99%以上。使用温度内标后Tm值标准较低大约0.056到0.027℃。

结论

内标提高小片段内的纯和基因型G/C和T/A碱基的改变。该研究被国家卫生部以下部分津贴支持：R44DK069106 、R44HD053215 to SFD 、 R42GM072419 和R42GM073396 to CTW。

背景

变性或熔解时，由于核酸固有特性的不同使得基因型信号会发生变化。基于探针的基因分型在相关的大量的等位基因特异性在温度变化几度上有较大的优势。高分辨率熔解曲线提供了整个双链的熔解图并且可以去掉探针。此外，每个实验当整个扩增子被监测时，获得的碱基审问数量增加达20倍。由于非常相似的熔解图和熔解温度，使纯和基因型在没有探针的情况下检测难度增加。小片段提供了一个简单的基因分型方案。
值得注意的是，与大片段扩增子相比小片段扩增能够更好的进行纯合子检测，因为特异基因型Tm值变化将更大。但是，某些因素可以影响大量纯合子的分离。从碱基类型Tm值变化到设备变化和样品和样品的不同都能影响基因分型。温度内标可以减小这些变化，固定熔解转变和提高基因分型的灵敏度。当小片段引物仅仅对侧翼的SNP匹配时，将会得到最好的结果。

方法

PCR反应体系10 μL，反应体系中加入1X LightScanner高灵敏度Mastermix，该Mastermix包含热启动酶，镁离子缓冲液，其它成分和核酸校准，该PCR的熔解区间大约在62C和92C。体系中包括0.10μM或0.15 μM的引物，人基因组DNA10-15 ng。PCR循环条件如下：95C预变性2min，94C/30s，64-67C/30s(根据实验而定)包含退火和延伸，45个循环。最后的退火条件为28C/30s。所有DNA样品的基因型通过探针法检测。
熔解在96孔板的LightScanner设备上进行，数据采集从55-97C。熔解后数据校准首先使用接近荧光数据的平滑线条，接下来，将使用该数据的线条插值峰计算Tm值。这一调整过程可以校准每个扩增子的熔解峰，以达到最小的变化。数据重新使用LightScanner软件进行分析。扩增子Tm值附近的温度区域用于分析（有或没有以前内标校准）同时以衍生峰显示。

结果

使用温度内标前的完整熔解图见图1，图中标出了从低温内标到高温内标的熔解图，中间为扩增子的熔解图。

图1. 衍生的熔解曲线显示了内标和扩增子的熔解峰。内标的熔解峰在左右两侧。94个熔解图产生于独立的PCR反应，熔解峰大约出现在76C。内标分子没有校准，纯合子的峰没有完全分开。中间最窄的和最高的峰是A/A(蓝色)和T/T(红色)，它是CPS1 A/T多态性的纯和基因型。先前基于探针的基因分型颜色已经增加,不是基于这个小片段熔解数据。中间的另一个峰是A/T杂合子峰。插图显示的是放大的熔解峰。
                       

图2. 使用温度内标能够改善衍生的熔解曲线。荧光图显示了CPS1、OTC,MSH2和PAH突变94个独立的PCR反应。双峰CPS1杂合子在校准前很容易被区分出来（图2a）。相反，OTC杂合子（图2c）仅显示了一条主要的峰，更多的峰在校准前很难区分。使用温度内标后的基因型数据分更加容易，重复反应中没有发现出现不同的基因型。