怎样选择色谱柱？（一）

怎样选择色谱柱

现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择.但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解.
1,正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团  (NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料.
由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品 中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱. 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿
(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等.
2,反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相. 反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物. 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有 更强的保留. 常用的反相填料有C18(ODS),C8(MOS),C4(B),C6H5(Phenyl)等.
二,聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用. 相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效. 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低.
三,其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化.由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的 用途.如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料.这种填料的分离不同与硅胶基质烷基 键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基 键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由 于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用.氧化铝也可用于HPLC, 氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用. 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用, 新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应 用PH范围1～14,温度可达100℃.由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难 度,其重要用途与优势尚在进行中.
怎样选择填料粒度
目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um, 5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压.粒度越小,填 充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度, 但不是唯一的因素.如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料 是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而, 3um的色相谱的背压却是5um的2倍.与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更 短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使 用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力. 一,如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;
◆ 使用填充良好的色谱柱;
◆ 尽量减少压力波动,避免机械及热冲击;
◆ 使用保护柱及在线过滤器;
◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;
◆ 充分过滤样品及流动相,尽量避免杂质微粒与强保留成分;
◆ 用稳定的固定相(C18最稳定);
◆ 在中等PH值操作(6~8),用有机缓冲溶液;
◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃;
◆ 硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;
◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;
◆ 流动相中含有缓冲溶液,应注意应95:5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低于5%;
◆ 过夜或贮存时,冲洗掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好).
HPLC固定相及应用范围
名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物.
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最 弱,典型用于中等极性和多官能团化合物.
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质,保留时间比C8和C18短.
MOS C8, -C8H17 √ √ 中等极性相中对中等化合物,小肽和蛋白质,
Octyl 极性药族化合物和环境样品.
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留最强.广 泛用于药物,甾族化合物,脂肪酸和环境样品.
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性,适合应用于正相
(propyl 分离,当用于反相系统时,其选择性与 C8和 Nitrile) C18不同,在药学领域和复杂混合物的分离中应
用广泛.
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物.弱阴离子交
(Amino Propyl) 换 ,阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性 剂 做流动相.正相中与硅胶的选择性机改性剂
不同,分析芳香族效果很好.
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物
Diol -(CH2)2O √ √ 反相时,分离肽和蛋白质.正相时,与硅选择
CH2(CH2OH)2 性 相似,但极性较弱.
SCX 强阳离子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有机碱交换
SAX 强阴离子 -(CH2)3N+(CH3)3 有机酸,核苷和核苷酸交换