高分辨率熔解曲线方法检测不同的DNA杂合体
文章来源：Clinical Chemistry 51, No. 7, 2005
Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting, Robert Graham,1 Michael Liew,2 Cindy Meadows,2 Elaine Lyon,2 and Carl T. Wittwer1,2* (1 Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; 2 Institute for Clinical and Experimental Pathology, ARUP, Salt Lake City UT; * address correspondence to this author at: Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT 84132; fax 801-581-4517, e-mail carl.wittwer@ path.utah.edu)
最近，高分辨率熔解曲线法（High-resolution melting）作为一种可以在小的扩增子中来检测单核苷酸多态性基因型的技术被引进。这种基于封闭小管子的方法（包括快循环的PCR）可以在15分钟内完成，并且不需要采用荧光定量PCR仪、等位基因特异性PCR和荧光标记的寡聚核苷酸。该过程通过采用可以检测异源双链DNA的染料得以实现，这种染料在饱和的程度下也不会抑制PCR反应。野生型和纯合子的样品可以通过熔解温度( Tm)的迁移来区别。杂合子样品和纯合子样品可以通过被改变的曲线形状来更好的区分，而不是通过熔解温度。杂合子样品可以产生溶解温度较同源双链更低的异源双链。杂合子产生的被放大的熔解曲线包括2个同源双链和2个异源双链，会产生一个倾斜的复合的熔解曲线。这种熔解曲线在形状上可以很容易与纯合子的曲线加以区别。
然而，在一个扩增子中不同的杂合子是否可以通过不同曲线的形状被区分出来还不太清楚。根据扩增后产生的同源和异源双链的情况，可以将SNPs分为四种类别。不同类别的SNPs异源双链的错配是不同的，因此，如果仪器的分辨率足够有效的话，它们的熔解曲线是可以被区别的。并且，在同种类别中，不同的杂合子也是可以被区别出来。尽管这种错配是相同的，但是最相近的参数稳定性却依赖于相邻碱基的错配，因此，预测出来的稳定性常常是不同的。
我们从ARUP实验室中选取用来做标准临床基因型鉴定的HFE, V Leiden因子和II型多态因子的DNA样品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法来抽提DNA，采用基于LightCycler的邻近杂交探针[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法来确定基因型。采用探针融合分析基因型的一个优点就是可以用探针鉴定出除了预期改变的序列以为的改变。在ARUP实验室中进行常规的临床分析时，一旦在意外的温度下出现了异常的熔解峰时，样品就会通过进一步的测序来确定序列的改变。在预计的突变附近的一些杂合的序列突变就可以被这样鉴定出来。三个II型杂合子因子（all SNPs），四个V 杂合子 (2 SNPs, 1 个单碱基的缺失和 1 个复合的杂合子)和 6 HFE杂合子 (4 SNPs and 2复合杂合子)可被用来做比较。在选择和完全鉴定样品之后，通过ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)来确定DNA的浓度。如果可以的话，每个杂合子基因型的3个样品可以被处理。
除非有必要重新设计引物来检测所有的序列突变，前面描述的引物可以直接去用。SNPWizard 可以(http://DNAWizards.path.utah.edu)被用来设计引物。引物通过Integrated DNA Technologies来合成，并且用的时候不需要进一步的纯化。除了将1X LCGreen ® PLUS (Idaho Technology)换成 LCGreen I外，PCR仍采用以前的程序来扩增。LCGreen PLUS比LCGreen I颜色更加鲜艳，并且可以被用在具有更宽广变化的熔解测定仪上。扩增时的扩增子的序列，引物区域和特定的PCR条件被列在数据附录的表1中。数据附录是和在线版本的技术简要说明（http://www.clinchem.org/content/vol51/issue7/）相匹配的。
PCR结束以后，毛细管在LightCycler中以20 °C/s的速度被加热到90 °C，然后以20 °C/s的速度冷却到40 °C以便更好的形成异源二聚体。将样品从LightCycler中取出，然后在高分辨率的熔解曲线仪(HR-1; Idaho Technology)上进行分析。每个毛细管在59 °C时被插到仪器中，温度以0.3 °C/s的速度上升，从65 到95 °C时获取荧光，此过程只需要1至2分钟。通过熔解前的快速降温，熔解过程中的快速加热以及低浓度的Mg离子浓度均有助于检测小的扩增子中异源二聚体。通过普通化的用户软件来分析熔解曲线，不同温度迁移的曲线以不同的图片形式被列出来。不同的图片显示出每个样品和“标准”（通常是多种野生型曲线的一个平均值）样品之间的区别，并且不应该与衍生图 (-dF/dT)相混淆，这种衍生图 (-dF/dT)常常被用来分析低分辨率的熔解数据。因为曲线形状和熔解温度的微小差别就会变得异常明显，因此，作为一种方便的方法，不同的图可从整体上观察高分辨率的熔解数据。
可以通过前面描述过的最近热力学模型（nearest-neighbor thermodynamic models）的计算来预测出的两个Tm值。该模型通过安装Melting Wizard (http://DNAWizards.path.utah.edu)而获得。没有必要去修正因dUTP 代替dTTP的渗入而造成的影响。为了最大程度的增加Tm的区别，扩增子的长度最好比较短，尽管在产物中要想证明SNP的类型常需要超过500 bp的长度。对于不同的SNP( 在线数据附录中的表格2)，计算出的Tm的差异在纯合的野生型和纯合的突 变型的扩增子中变化范围在0.0°C到1.3 °C之间。对于单个的SNP来说，与最稳定的同源双聚体相比，异源双聚体的不稳定性常在1.1°C到3.0 °C之间变化，而与最不稳定的同源双聚体相比，异源双聚体的不稳定性在0.7°C到2.2 °C之间变化。对于复合杂合子来说，各自的不稳定性在2.8–4.0 °C 和2.0–3.5 °C之间。