发布时间:2020-07-27 17:52 原文链接: 离心技术原理与类型(一)

离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一,也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。
离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多,按照使用目的,可分为两类,即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料,每次分离样品的容量比较大,后者则主要用于研究纯品大分子物质,包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质,每次分析的样品容量很小,根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测),能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同,故其主要结构也有差异。

离心原理
将样品放入离心机转头的离心管内,离心机驱动时,样品液就随离心管做匀速圆周运动,于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同,在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同,由此便可以得到相互间的分离。
离心力和相对离心力
溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力,其定义为:
F = mω2r
式中:
F 为离心力的强度; m 为沉降颗粒的有效质量;
ω 为离心转子转动的角速度,其单位为rad/s;
r 为离心半径(cm),即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。
很显然,离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大,而随着离心半径的减小而降低。目前离心力通常以相对离心力Fcf 表示,即离心力F 的大小相对于地球引力(G)的多少倍,单位为g,其计算公式如下:
Fcf = 1.119×105(h)2r×g
可以看出,在同一转速下,由于f 的不同,Fcf相差会很大,实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中,Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来,因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数,而与样品并无直接的关系。
沉降速度与沉降系数
一个颗粒要沉降,它必须置换出位于它下方等体积的溶液,这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到,否则,在离心过程中颗粒将发生向上漂浮,而不是下沉。当颗粒在运动时,不论方向如何,它都要穿过溶剂分子,所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。
摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比,并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响:

式中:
f 为颗粒在济剂中的摩擦系数.与颗粒的大小、形状及介质性质相关;
v 为颗粒的沉降速度。
由于离心力的存在,颗粒将加速运动直到摩擦力与离心力相等。在这种情况下,颗粒所受到的净作用力为零,颗粒将以最大速度运动。

式中 Mp 和M s 分别为颗粒的质量及等体积的溶剂的质量。
上式中的Mp 和M s 很难确定,为了建立分子大小与沉降系数之间的关系,引入了沉降系数这一新的概念。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度,它以svedberg单位计算,1S=1×10-13 s。例如,核糖核酸酶A 的沉降系数为1.85×10-13 s,即可记作1.85S。
近年来,在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中,对于某些大分子化合物,当它们的详细结构和分子量不很清楚时,常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30 s 亚基和50s 亚基,这里的s 就是沉降系数,现在更多地用于生物大分子的分类,特别是核酸。
离心技术的类型

最大速度方法
(1)移动界面超速离心法
含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时,每种颗粒都达到其最大沉降速度,这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液,并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面,界面的移动相对于每种组分来说是特征的。

虽然利用这种方法不一定能实现组分的纯化分离,但可以通过监测界面的移动来测定各组分的沉降速度。要想实现组分间的分离,必须在所需样品沉降之后停止离心过程。沉积的样品再悬浮到新的溶剂中,并以较低的速度离心使大颗粒的污染物沉降,而被纯化的样品留在溶液中,经过反复多次地离心才能得到纯的样品,这种方法就叫差示沉降离心法,它对细胞组分间的分离非常有用。也可以通过逐渐增大转速的方法实现不同组分间的分离,

细胞匀浆差示分离
(a)细胞匀浆;(b)细胞碎片;(c)线粒体、过氧化物酶体、溶酶体;(d)微粒体、核糖体;(e)细胞液;(可溶性蛋白质及小分子生物)
(2)移动区带超速离心法
差示离心法离心前各组分均匀分布在整个溶液中,所以分离一般不理想,而移动区带超速离心法是一种密度梯度(Dens 心Gradient)离心技术,在离心之前离心管中溶液的密度不同(从上到下密度增大),梯度介质中最大密度应小于样品物质的最小密度,其特点是物质的分离取决于样品物质颗粒的质量.即样品物质的沉降系数,而不是取决于样品物质的密度,因而适合于分离密度相近而大小和形状不同的物质,这属于一种非平衡态分离法。当样品物质轻轻地铺在密度梯度介质的液面上,起动离心机,在离心力的作用下,一定时间后便形成不同物质的区带。当继续离心时每个区带会逐一达到管底,所以,在沉降最快的区带到达管底之前要停止离心,并将每个区带分部收集。最常用的制备密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化铯和硫酸铯等。