细菌基因组DNA提取实验

实验方法原理 本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术，结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。适合于从1.0×109 细菌中获得多至20 μg 的基因组DNA。用于PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。

实验材料 细菌培养物

试剂、试剂盒 细菌基因组DNA试剂盒

仪器、耗材 DNA 制备管小量滤器离心管

实验步骤

一、试剂盒组成、贮存、稳定性

1.  说明书，耗材：DNA 制备管，小量滤器，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。

2.  RNase A：50 mg/ml，室温保存。

3.  溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml，-20℃密闭贮存。

4.  Buffer S：细菌原生质制备液，加入RNase A 后，4℃密闭贮存。

5.  0.25M EDTA：室温密闭贮存。

6.  Buffer G-A：裂解液，室温密闭贮存。

7.  Buffer G-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。

8.  Buffer DV-A：Buffer DV 的制备液，请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制，室温密闭贮存。

9.  Buffer DV：相分离液，室温密闭贮存。

10.  Buffer BV：DNA 结合液，室温密闭贮存。

11.  Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

12.  Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。

13.  Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备

1. 第一次使用时，在Buffer W2 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。

2. 准备Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 异丙醇，75 ml 异丁醇，加入提供的250 ml 试剂瓶中，混合均匀。

3. 4℃预冷Buffer DV。

4. 第一次使用试剂盒时，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50 mg/ml。

5. 第一次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均匀。

6. 准备65℃水浴。

7. 检查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出现沉淀，若出现沉淀，于65℃水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。

8. 将Eluent 或去离子水加热至65℃有利于基因组DNA 的充分洗脱。

三、操作步骤

1. 用2 ml 离心管收集1.0×109（1 ml 菌液OD600 为1-1.5）的细菌培养物，12 000×g 离心30 s，弃尽上清。用150 μl 已加入RNase A 的Buffer S 悬浮沉淀。

* 确认RNase A 已加入Buffer S 中。

* 悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则将影响溶菌效果。

2. 加入20 μl 溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5 min。

3. 加入30 μl 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5 min。

4. 加入450 μl Buffer G-A,旋涡振荡15 s，65℃水浴10 min。

5. 加入400 μl Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃预冷），用力混合，12 000×g 离心2 min。

* 请在实验前按照实验准备步骤2 内容，准备Buffer DV。

6. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1 ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12 000×g 离心2 min。

7. 丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2 ml 离心管中）。12 000×g 离心1 min。

* 上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃。

* 如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可过滤除去。

* 有色上相务必除尽，否则将抑制DNA 结合到silica 膜上。

8. 弃滤器，在滤液中加入400 μl Buffer BV，混合均匀。

步骤9-12 可选择离心法或负压法

A. 负压法

9A. 将制备管插到负压装置的插口上，将步骤8 中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，吸尽管中溶液。

10A. 保持负压，加入500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。

11A. 保持负压，沿管壁四周加入700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 μl BufferW2 洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

* 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于彻底冲洗沾附在管壁上的盐份。

* 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

12A. 将制备管置于一个2 ml 离心管中，12 000×g 离心1 min。

B. 离心法

9B.  将制备管置于2 ml 离心管中，将步骤8 中的混合液移入制备管中，12,000×g 离心1 min。

10B.  弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入500 μl Buffer W1，12 000×g 离心1 min。

11B.  弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，加入700 μl Buffer W2，12 000×g 离心1 min。

以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

* 两次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

12B．弃滤液，将制备管置回到原2 ml 离心管中，12 000×g 离心1 min。

13. 将制备管置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加100-200 μl Eluent 或去离子水，室温静置1 min。12 000×g 离心1 min 洗脱DNA。

* 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。

注意事项

1.  Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。