相互作用克隆实验

实验方法原理

它需要一种编码诱饵蛋白的基因和用噬菌体表达载体，如 λgt 11 构建的适当的表达文库。编码诱饵蛋白的基因常用于在中合成重组融合蛋白。重组融合蛋白使用具放射性的 [32P] 作标记。由于 cAMP 依赖蛋白质激酶（蛋白质激酶 A，PKA）的识别位点被引入重组融合蛋白质，从而可通过 PKA 和 [γ-32P]ATP 使它酶促磷酸化。此标记蛋白质可作为探针筛选源于 λ 噬菌体的 cDNA 表达文库，这种文库读框表达 β-半乳糖苷酶融合蛋白。噬菌体裂解细胞形成噬斑并释放融合蛋白，融合蛋白吸附到硝酸纤维滤膜上，用过量的非特异性蛋白封闭滤膜来排除非特异性结合，再用放射性标记的诱饵蛋白检测。

实验材料 cAMP依赖型蛋白质激酶纯化的GST-诱饵蛋白质融合体（带有 PKA 识别位点）E.coli Y1090 r- 或其他适当的宿主菌

试剂、试剂盒 DTTPKA缓冲液 [γ-32P] ATPZ'-KClSephadex G-50LB培养基MgSO4IPTG顶层琼脂糖Tris 缓冲盐溶液（含 Triton X-100）印度墨水HEPES 封闭缓冲液（HBB）结合缓冲液（BB）悬浮培养基（SM）氯仿

仪器、耗材 3 ml 一次性塑料柱／一次性注射器和玻璃棉闪烁计数仪闪烁液台式离心机硝酸纤维滤膜22-G针头

实验步骤

1. 在 25 μl 新鲜制备的 40 mmol/L DTT 中重悬 250 U/μl PKA，并在临用前置室温约 10 min。

PKA 可暂时保存在 4℃，但活性只能保持 2~3 天。

2. 制备含以下成分的磷酸化反应的混合液：

1 μl 10 U/μl PKA（从步骤 1 获得）

3 μl 10 × PKA 缓冲液

5 μl 10 mCi/ml（6000 mCi/mmol）[γ-32P] ATP

1~10 μl（约 1 μg）纯化的 GST-诱饵蛋白质融合体

补加 H2O 至 30 μl

于室温孵育 1 h。

与诱饵蛋白不相连但含有 PKA 识别位点的融合体亦应该表达用作对照来测定观察到的相互作用 是否是特异性针对诱饵蛋白质的。最好同时标记诱饵蛋白和未与诱饵蛋白相连的融合体（在不同的反应中）。

3. 加入 170 μl 冰冷的 Z'-KCl（中止反应）并于冰上保存待用。

4. 将在 Z'-KCl 中平衡好的 Sephadex G-50 倒入 3 ml 一次性塑料柱（或 3 ml 玻璃棉塞的注射器）中，最终床体积约为 3 ml。允许柱中缓冲液流出至柱床顶部的水平。

5. 将所有磷酸化反应物（从步骤 3 获得）加样到层析柱中并用 1.5 ml 离心管收集流出 液。置第二支试管，加入一份 200 μl Z'-KCl，并收集流出液。再重复 10 次上述的加入和收集步骤，总共收集 12 份 200 μl 流出液。

6. 使用闪烁计数仪测量契仑科夫数以确定含有最高特异活性的流出液，并计算 cpm/μl。

典型的情况是可见到两个强信号峰：第一个峰在第 5~9 份流出液之间，由标记蛋白质产生。遗弃第二个峰，它由未结合的 ATP 产生的。

7. 可选：用 SDS-PAGE 分析小量（1~2 μl）的 32P 标记的蛋白质探针并作放射自显影。

典型的情况是可见到两个强信号带：一个处在 GST-诱饵蛋白融合体的预计分子质量大小的位置， 而另一个处在非融合的 GST（28 kDa）预计分子质量大小的位置。这是因为在融合蛋白中 GST 与诱饵蛋白结合处本身对蛋白酶裂解敏感。在探针中出现标记的 GST 蛋白应该不会干扰筛选；在后续筛选阶段应补加标记 GST 的对照实验。

8. 作系列稀释，测定噬菌体 cDNA 文库的滴度。

9. 在含适当选择性抗生素、10 mmol/L MgSO4 和 0.2% 麦芽糖的 LB 培养基中过夜培养 50 ml E.coli Y1090 r-(或其他合适的宿主菌）。于室温以 2000 g 离心细菌细胞 10 min，再用 25 ml 10 mmol/L MgSO4 重悬细菌细胞。

10. 于室温在 10 mmol/L IPTG 中浸泡硝酸纤维素滤膜 15 min，然后空气干燥。

11. 准备 8 个 1.5 ml 离心管，每管含有 600 Y1090 r-细胞（来源于步骤 9）和约 40000 pfu 噬菌体（来源于步骤 8），并于 37℃ 浮育 15 min。将每管中的内容物倒入 47℃ 含 7 ml 0.7% 顶层琼脂糖的试管中并迅速倒入 150 mm LB 平板中（如果需要也可是含抗生素的 LB 平板）。于 42℃ 培养平板约 3 h，直至生长出可见的微小噬斑。

12. 将 IPTG 溶液预饱和滤膜铺在平板上并于 37℃ 继续培养 6~8 h。于 4℃ 将平板冷却 15 min（或过夜）。

噬斑形成的过程中不诱导 lacZ 基因启动子，确保了在噬菌体形成噬斑时不表达任何一种对噬菌体生长有毒的文库编码蛋白质。

通常浸透 IPTG 的滤膜孵育 6~8 h，为方便起见，可与浸透 IPTG 的滤膜孵育过夜。

13. 用蘸有印度墨水的 22-G 针头在每个滤膜刺几处以标记方向。从平板上移去滤膜并用 TBS-T 于室温振荡洗涤 15 min。将滤膜浸泡在 100 ml HBB 中于 4℃ 摇摆 1~4 h（或过夜）。

14. 再将滤膜浸泡在含有 2.5 × 105~5 ×105 cpm/ml 同位素标记的融合蛋白（从步骤 6 制备）的 BB 中于 4℃ 摇摆过夜。

所有 8 张滤膜可置于一个 150 mm 平皿中并浸泡在 30~40 ml 探针溶液中。用石蜡膜将平皿封口， 然后放在一个有机玻璃箱中屏蔽起来。另外，也可将滤膜和溶液放在封口袋中。探针溶液可于 4℃ 保存并可反复用于次级和三级筛选。

15. 于室温在 100 ml BB 中振荡洗涤滤膜 3 次，每次 10 min。空气干燥后压片。

16. 使用巴斯德吸管较大的一端，在阳性克隆的位置插入取出琼脂糖块。将其置于一个 1.5 ml 微量离心管中，然后加入 1 ml SM 和一滴氯仿。经系列稀释测定滴度并进行连续筛选以期获得纯化克隆。

琼脂糖块可于 4℃ 保存数月。因此，如果在初级筛选中确认了许多假定阳性克隆，视需要可将它们全部保存起来留待以后分析。

接下来的筛选在 100 mm LB 平板上进行，次级筛选用约 2000 pfu/平板，而三级筛选用约 300~500 pfu/平板。在获得均一性克隆之前（通常在三级筛选期间），应进行对照实验排除可能与探针 GST 融合部分相互作用的克隆。做该实验时可将滤膜剪成两半，用与标记的 GST-目的蛋白融合体探测其中一半，而另一半用标记的 GST 或未标记的对照 GST 融合蛋白质检测。

注意事项

在本方案中使用了放射性标记物，应小心操作并采用适当的屏蔽保护。