一、蛋白质印迹法
蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白质样本进行非直接的检测。在常规的蛋白质印迹中，蛋白质样本首先通过 SDS-PAGE 进行分离，然后电转移到膜上。在用不相关的蛋白质封闭膜之后 ，用与靶抗原结合的一抗 (多克隆抗体或单克隆抗体) 与膜孵育。接着清洗膜，再用可与一抗发生反应的酶联二抗孵育。然后再次清洗膜，将其在合适的酶底物中孵育。如果使用比色底物的话, 信号可以目测，如果用化学发光和荧光底物，则 可 利 用 X 射线胶片或成像设备测得信号。
蛋白质印迹方法学中几个最重要的进步包括高灵敏度增强化学发光底物、成像系统和最近出现的多种见光稳定的荣光剂= 超尚灵敏度的化学发光底物 的广泛应用几乎取代了同位素标记的探针的使用。用125I 标记的蛋白质 A 或蛋白质 G 曾一度广泛用做二级检测剂，但如今增强化学发光底物就可检测到低至飞克 (femtogram) 数量级的蛋白质，并且具有高信噪比。
电荷親合元件 (charged-coupled device，CCD) 成像仪在大多数实验室中都十分常见。成像仪具有较大动态范围和高程度曝光控制, 这使得背景信号能够自由调节。此外 ，成像仪所附带的分析软件能够完成光密度分析。尽 管 X 射线胶片仍然应用广泛且灵敏度更高，但 是 CCD 成像系统却可以避免处理胶片和显影的麻烦，并且也不会产生化学废物。
近 来 ，荧 光 剂 染 料 发 展 迅 速 ，这 要 归 功 于 新 一 代 荧 光 团 。与 传 统 荧 光 团 相 比 ，它 们 在亮 度 、光 稳 定 性 及 p H 灵 敏 度 上 有 着 巨 大 的 进 步 。通 过 荧 光 检 测 的 蛋 白 质 印 迹 检 测 法 通常 用 于 同 一 印 迹 中 需 要 检 测 两 种 不 同 靶 抗 原 时 。而 突 光 团 对 的 选 择 基 于 它 们 不 同 的 可 区分 开 的 激 发 -发 射 光 谱 。易 辨 别 的 颜 色 差 异 能 够 使 多 色 检 测 实 验 顺 利 完 成 。最 值 得 注 意的 是 ，这 些 新 型 荧 光 染 料 结 合 软 件 的 运 用 ，可 实 现 细 胞 信 号 通 路 的 检 测 和 定 量(Chou d h a r y et al ,2007；T i p s m a r k et al. ,2008)
二、蛋白质印迹法的种类
2.1 直 接 与 间 接
直 接 蛋 白 质 印 迹 法 是 指 利 用 标 记 报 告 系 统 的 一 抗 直 接 与 靶 蛋 白 结 合 。间 接 蛋 白 质 印迹 法 则 利 用 标 记 的 二 抗 (R a m L a U ，1987) 与 未 标 记 的 一 抗 相 结 合（图 33. I h 由 于 无 需 与二 抗 孵 育 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 比 间 接 蛋 白 质 印 迹 法 耗 时 较 短 。此 外 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 也避 免 了 因 二 抗 交 叉 反 应 所 造 成 的 背 景 信 号（Bergendahl et al. ,2003)。直 接 蛋 白 质 印 迹法 还 可 同 时 探 测 多 种 靶 物 质 。但 是 有 时 在 免 疫 反 应 中 , 标 记 一 抗 会 有 不 利 影 响 ，并 且 即 便在 最 好 的 情 况 ，标 记 过 的 一 抗 也 无 法 进 行 信 号 放 大 。因 此 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 的 灵 敏 度 通常 要 低 于 间 接 检 测 法 ，并 且 只 能 在 靶 抗 原 丰 度 较 高 时 使 用 。能 够 放 大 信 号 并 不 使 用 二 抗的 间 接 检 测 法 称 为 一 抗 生 物 素 化 。用 生 物 素 化 的 试 剂 标 记 一 抗 通 常 使 每 个 抗 体 分 子 带 有超 过 一 个 生 物 素 。每 一 个 生 物 素 都 能 够 和 酶 联 的 亲 和 素 、链 霉 亲 和 素 或 T h e r m o Scientific NeutrAvidin Protein® 发 生 反 应 。这 些 多 酶 体 系 催 化 了 合 适 的 底 物 的 转 化 ，以 此 放 大信 号 。基 本 上 ，亲 和 素 偶 联 物 替 代 了 二 抗 , 并 且 其 物 质 的 量 浓 度 和 二 抗 原 本 的 物 质 的 量 浓度 几 乎 相 同 。但 是 需 要 注 意 , 如 果 用 于 凝 胶 中 的 样 本 是 天 然 生 物 素 化 的 ，尤 其 是 在 使 用 高灵 敏 度 底 物 时 ，产 生 的 信 号 很 有 可 能 会 干 扰 靶 蛋 白 的 检 测 。
2.2 far-Western
有 时 , 针 对 一 种 特 定 抗 原 的 抗 体 在 蛋 白 质 印 迹 分 析 时 并 不 适 用 ，或 者 无 法 获 得 。然而当 靶 蛋 白 结 合 物 可 充 当 探 针 时 ，印 迹 法 仍 然 可 行 。这 种 类 型 的 应 用 便 称 为 far-WestemBlot, 通 常 用 于 蛋 白 质 -蛋 白 质 相 互 作 用 的 发 现 或 确 认 。关 于 这 个 主 题 的 变 化 颇 多 ，并 涉及 前 文 所 述 的 所 有 方 法 策 略 。此 时 标 记 过 的 结 合 物 就 相 当 于 一 抗 , 可 通 过 与 35S 体 外 翻 译反 应 进 行 标 记 。也 可 以 将 探 针 生 物 素 化 ，并 用 亲 和 素 或 类 似 亲 和 素 的 偶 联 物 检 测 ，这样能够 更 好 地 放 大 信 号 。必 须 注 意 探 针 不 宜 过 度 标 记 ，因 为 这 会 减 弱 它 与 靶 物 质 的 反 应 能 力 。或 者 ，可 将 带 标 记 的 重 组 探 针 在 细 菌 中 表 达 (标 记 可 选 择 G S T 、H A 、c-M y c 或 F L A G ) ，通过 识 别 这 些 标 签 的 标 记 抗 体 实 现 检 测（Burgess et aL ,2000)。