昆虫病毒的培养实验

实验方法原理

培养昆虫病毒主要采取组织培养和感染宿主两种方法，后者比较容易成功，使用更为广泛。本实验以斜纹夜蛾（Prodenialitura）核型多角体感染宿主来培养病毒。

斜纹夜蛾能危害棉花、蔬菜等多种作物。核型多角体病毒是多角体病毒侵入宿主细胞后，在细胞核内形成多角体，多角体内包含着很多病毒粒子。斜纹夜蛾多角体的形状有三角形、四角形、五角形、六角形和圆形，直径大小在 1.2～3.4 μm，用普通显微镜即可观察到。多角体蛋白可被碱性溶液溶解，而释放出病毒粒子。因此，多角体通过污染食物经口感染后，被昆虫的碱性胃液所溶解，释放的病毒粒子通过中肠上皮组织而进入血腔，在脂肪组织及其他组织（包括血细胞）中增殖。斜纹夜蛾感染病毒后明显的特征是体色变化， 30℃ 下感染后 3 d 左右幼虫腹面体色由正常的绿色变为粉红色。发病后期，食欲减退，行动迟缓，死亡前半天到一天，停止摄食，排稀粪，幼虫常向上爬行，在自然界常倒悬或附着于枝叶上而死亡。在病毒大量繁殖后，血液中出现大量多角体，通过皮肤可以看到血液呈混浊状，此时皮肤脆弱易破有时前腹背后端破裂，流出乳白色或稍带粉红色液体，似脓汁，具有很强的感染性。

实验材料 斜纹夜蛾核型多角体病毒材料（保存于冰箱的虫尸）三龄斜纹夜蛾幼虫

试剂、试剂盒 蓖麻或甘薯叶片1％ 漂白粉或 5％ 石灰水甘油

仪器、耗材 玻璃缸纱布血球计数板显微镜离心机

实验步骤

1. 病毒悬液制备

1.1 将斜纹夜蛾核型多角体病毒材料加适量蒸馏水置研钵中研磨，加水稀释并通过两层纱布过滤，再将滤液离心（3000 r／min 离心 30 min）。

1.2 将离心后的沉淀物用蒸馏水悬浮，并再离心，这样反复多次，即可得到初部提纯的白色多角体。

1.3 将提纯的多角体先用适量的蒸馏水均匀悬浮，并用血细胞计数板计数，然后再加水使稀释成每毫升含 1×108 个多角体的悬液。

1.4 向上述悬液中加入每毫升含青、链霉素各 1500～2000 单位，以防止杂菌污染。

2. 接种

2.1 将由田间采来的健康三龄斜纹夜蛾幼虫放于玻璃缸内，缸口用多层纱布盖好。虫口密度一般在 33 mm2 一头左右为宜。

2.2 用 1％ 的漂白粉液或 5％ 石灰水浸泡蓖麻或甘薯叶片进行消毒，然后再用清水洗涤，晾干后，用上述核型多角体悬液浸泡或用蘸有多角体悬液的棉球涂抹，晾干。

2.3 待幼虫经短时间的饥饿以后，将晾干的带毒叶片放于玻璃缸内供食，通过幼虫口食接种病毒。供食带毒叶片的次数可为 1～3 次，一般供毒次数多则发病率高。盖好纱布后，置 30℃ 温室培养。

2.4 培养过程仍需喂食，加强管理与观察。

3. 收获与保存

3.1 在幼虫死亡前，虫体变白，通过皮肤看到血液混浊时，在尾角或腹脚处剪破，收获脓汁，保存于甘油水溶液（水：甘油＝1：2）中，置冰箱保存。

3.2 或将脓汁经洗涤、离心，取多角体沉淀加乳糖制成糊状，冷冻干燥保存。

3.3 若整个死虫保存，则将未放出脓汁的病死虫直接放甘油水溶液中，冰箱保存。

4. 涂片镜检

4.1 从尾角或腹脚取血涂片，加上盖玻片。

4.2 于（600×）高倍镜下观察。