小型连续发酵实验

实验方法原理 在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长，培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。

实验材料 大肠杆菌

试剂、试剂盒 牛肉膏蛋白胨培养基葡萄糖NaClNa2HPO4 (NH4)2SO4

仪器、耗材 连续培养装置

实验步骤

一、实验主要仪器设备和材料

简单连续培养装置（见图1）

菌种：大肠杆菌（E. Coli）；

培养基：基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；

发酵培养基：葡萄糖，NaCl，Na2HPO4， (NH4)2SO4。

二、实验方法、操作步骤

1.  还原糖的测定：3,5－二硝基水杨酸比色法测定（具体操作步骤见实验淀粉酶的固态发酵实验）

2.  蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法

3.  大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验细菌增殖曲线的测定）

大肠杆菌接种于母种培养基，在37 ℃培养6 h，将培养液在3 000 rpm离心10 min，倾去上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为107个/ml，接种于发酵培养基，在相同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为对照组，将上述菌液于600 nm波长比色（要求消光度在0.3-0.6间，如果超过用未接种的培养液适当稀释），然后将培养液在红外线烘箱110-120 ℃内烘干至恒重，以菌悬液OD值为纵坐标，相对应的菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率1/K。

K＝生物量/OD值

4.  制备好的发酵培养液倒入2 L的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管，玻璃管上端接内径3 mm、外径5 mm的橡皮管。用弹簧夹夹住，灭菌备用。

5.  灭菌后冷却至30 ℃的三角瓶安装于恒温水浴中培养。

6.  将大肠杆菌培养液以10％的接种量接入三角瓶中，先进行搅拌间歇式培养，若有无菌空气导管，也可通气搅拌培养。

7.  将补料用的3 L培养基装在3 L的三角瓶中，将送料的橡皮管的一端插入，用棉塞固定，另一端用油纸包好，灭菌备用。

8.  定时取出测定间歇培养的菌液浓度，以求出增殖速度。

μ=dx/xdt

⇒μt=dx/x

⇒μ(t2－t1)=ln(x2/x1)

⇒μ= (lnx2－ln x1)/ (t2－t1)

9.  取下输液用的橡皮管，剥去牛皮纸纸，与蠕动泵进液口相接，将培养器的输液橡皮管接到蠕动泵出液口。

10.  据菌体增殖速度，以较小稀释率开始流加培养基，此时稀释率须小于此增殖率。

F≤μ⇒F≤(lnx2－ln x1)/ (t2－t1)  

三、实验结果  

1.  将测定的OD600值及相应的生物量填入下表。

2.  绘制大肠杆菌连续发酵过程中的还原糖、蛋白质浓度和生物量的时间曲线(注明何时补料)。