六、中期染色体标本的变性
1.在染色缸中加入大约50mL变性液，将染色缸放于75〜76℃水浴中。预热变性液使其温度达到（73±2)℃。
2.从-20℃冰箱中取出实验所需的标本，室温下系列乙醇脱水，各2min。
3.室温干燥片子（5min)，或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本干燥。
4.在37〜40℃电热板上预热片子30s。
5.将标本浸入（73±1)℃的变性液中变性2.5〜5min。
6.迅速取出标本，放入冰冷的70%乙醇中3min，然后在85%和100%乙醇中脱水各3min。
7.晾干标本玻片（5min)，或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本干燥。
七、探针变性
在中期染色体标本片系列乙醇脱水的同时，将装有CGH探针的离心管在(75±1)℃水浴中变性10min。
八、杂交
1.将注射器针筒（已将枕头去掉）中吸入橡皮泥。
2.将标本片在37〜40℃电热板上预热片子约1min。
3.标本片在电热板上，将每个CGH探针加到标本的同一个杂交区域上，每个杂交区域盖上22mm×22mm玻璃盖玻片。
4.用注射器挤压橡皮泥，沿着盖片边缘进行封片。
5.37℃湿盒中孵育标本2〜3d。
九、杂交后洗脱
1.在染色缸中加入大约50mL的2×SSC溶液，预热使其温度达到72℃左右（水浴锅温度设置在大约75℃)。
2.在染色缸中加入大约50mL的4×SSC溶液，预热使其温度达到37℃左右（水浴锅温度设置在大约39℃)。
3.在染色缸中加入大约50mL的4×SSC/0.1%Triton×-10O溶液，预热使其温度达到37℃左右（水浴锅温度设置在大约39℃)。
4.在染色缸中加入大约50mL的2×SSC溶液，室温放置。
5.在染色缸中加人大约50mL的蒸馏水，室温放置。
6.从标本片上除去橡皮泥。
7.轻轻滑掉盖片（不要划伤标本)。
8.将标本片置于（72±2)℃的2×SSC溶液中，晃动标本片2min，然后在该溶液中停留5min。
9.将标本片转移到37℃的4×SSC溶液中放置5min。
10.将标本片转移到37℃的4×SSC/0.1%TritonX-100溶液中放置5min。
11.将标本片转移到37℃的4×SSC溶液中放置5min(可使用与步骤9中的同一溶液)。
12.将标本片转移到室温下的2×SSC溶液中停留5min。
13.将标本片转移到室温下的水中停留5min。
14.标本片自水中取出，置于暗处室温晾干；或在实验室抽风橱中微风吹过标本使标本快速干燥。
15.在标本片的靶区域上加10μL DAPI复染剂。
16.盖上盖玻片。
17.将标本片置于暗处5〜10min，然后进行CGH图像抓取和分析。
18.拍摄至少常染色体各10个，性染色体各7个。
收起
注意事项
1.一般选择正常男性对照，这样使得一张中期染色体标本片中同时有X染色体和Y染色体。
2.如果初步细胞遗传学分析已在其他实验室完成，患者的血样应放入有肝素钠的管中，可随后进行提取DNA或需要的话进行外周血培养用于FISH实验。在这种情况下，采血量最好超过3mL。如果患者是婴儿，采血量通常小于3mL，只要血量足够进行DNA提取即可。
3.可以提取大量男性和女性参考DNA，储存在-20℃备用。
4.每批新的DNA酶要进行0.0〜0.1U/mL的浓度梯度实验，通过琼脂糖凝胶电泳以确定哪种浓度能得到最理想大小的DNA片段，一般用该浓度的DNA酶进行标记效果理想。
5.—次标记超过1μgDNA可得到大量的标记参考DNA，可歸存在-20℃。
6.应制备一张标本片进行预试验以确定有丝分裂指数，评估是否需要用固定液稀释细胞悬液，或离心后用较少体积的固定液重悬细胞。
7.—张载片上滴两个区域，可以在一张片子上同时进行两个不同的CGH实验，但是应确保两个区域的染色体都分散良好。
8.进行中期染色体标本片的制备，其目标是：①得到的中期染色体分散均匀、相当染色体臂比较直、染色体之间重叠较少；②载玻片和染色体上残留的细胞质尽可能少；③相差显微镜下观察中期染色体呈现灰色[不太黑和（或）太亮，也不太浅或太朦胧]。
9.中期染色体标本片的质量是CGH过程中最关键的因素。每批标本片都应进行预实验，质量比较好的标本片储存在-20℃。在滴制片后约两周进行预实验，一旦结果满意，在-20℃储存这批标本片。一般整批标本片的质量相似，如果一批标本片没有得到满意的结果，这批标本片可以用于其他实验如FISH，或扔掉。在精通中期染色体标本制备的实验室中，应该首选他们常用的中期染色体制备方法。许多情况下，能满足注释8中标准的中期染色体同样适合CGH分析。
10.制备CGH探针时，应考虑制备两种不同的探针，一种是与患者性别相同的参考探针，另一种是性别不同的参考探针。性别相同的探针在揭示染色体(包括性染色体）的不平衡性染色体异常时非常重要。如果一张片子的两个杂交区域采用两种探针（见注释7)，性别不同的参考探针可以作为内对照，因为预期整条性染色体颜色比率不同。
11.标记病例（marker case)中采用约20μgCot1-DNA，而所有其他病例中采用约30μgCot1-DNA。绝大多数的标记染色体含有着丝粒，对于某些病例采用较少的Cot1-DNA提高检测效能。
12.变性液应预热至少30min。溶液可在微波炉中用最高档20s以加速预热过程。
13.确定每批标本片的最适变性时间。合适的标本在较大范围的变性时间内都可得到好的杂交结果和DAH反转带型。最初变性时间可以尝试3.5〜4min。