基因插入位点和模式实验（一）

实验材料 dCTP

试剂、试剂盒 乙醇次氯酸钠β-葡萄糖醛酸酶基因活性测定液溴化乙锭

仪器、耗材 培养室MS 培养基

实验步骤

一、转基因插入位点的数目

第一代（ T0）转基因植株外源基因的插入位点数目，一般都是通过遗传方法进行鉴定。虽然遗传分析可以在任何世代进行，但是一般选择转基因植株自交，或与野生型测交后得到的第二代（T1 ) 进行 。对代转基因植株，统计目的基因表达与不表达的个体，可以获得表型的分离比； 而对 T1 代转基因植株，统计含与不含目的基因的个体，则可以得到群体基因型的分离比。在估测转基因插入数目时，经常会采用前一种方法。但是，通过表型鉴定获得的结果，经常会低于实际情况； 通过基因型鉴定所获得的结果，则可以准确判定转基因的插入数目。对 T0 代及其子代分析结果的比较，同样也可以提供转基因插入位点数的信息。最近几年，精确评估转基因插入数目，对发展 “基因清除”技术起了重要作用，这一技术主要是通过多个 T-DNA 区共转化，获得不含任何选择性标记基因的转基因植株。转基因植株中外源基因的插入位点数与外源基因的拷贝数并非完全一致的，因为在同一插入位点有可能会含有多个拷贝，也有可能是以单拷贝的形式插入多个不同的位点。

1. 转基因表型的分离

T0 代转基因植株自交或杂交可以获得 T1 代，用代植株可以评价外源基因的表达情况。转入植物基因组的任何外源基因都可以用乃代植株的表型来分析，筛选 T。代转基因植株的选择性标记基因，也常应用于鉴定 T1 代转基因植株外源基因的表达。若目标基因的表型容易观测的话，同样也可以用于几代转基因植株的表型分析，如通过碘染试验可以方便地观测与植物淀粉合成相关基因的表型。卡那霉素和潮霉素等抗生素，也可以分别用于鉴定转基因后代中含有卡那霉素基因和潮霉素基因等相关抗性基因的阳性植株（见注 1) 。另外，通过将草丁膦、磺酰脲或草甘膦等除草剂喷洒幼苗或涂叶，也可以快速地鉴定出含有 BAR、ALS 或 EPSP 等功能基因的转基因植株。而 β-葡萄糖醛酸酶基因、LUC 和绿色荧光蛋白基因等报告基因通常用于检测乃代植株的外源基因表达。无损伤表型鉴定，如观测绿色荧光蛋白基因或 LUC 的表达，优于有损伤表型鉴定，如葡萄糖醛酸酶基因染色或抗性检测，因为前者可用于外源基因未表达的代植株的后续分子检测。

在事件 1 和事件 2 中，凡代转基因植株由 T。代植株自交获得，其 β-葡萄糖醛酸酶基因活性主要通过胚乳、叶片和根的组织化学染色方法测定。

( 1 ) 胚乳染色时，种子先用 70% 的乙醇杀菌 30s，然后用 50% 的饱和次氯酸钠溶液浸洗 15 min，再用无菌去离子水洗三次，第三次漂洗后浸数小时。在超净工作台上用灭过菌的解剖刀将处理好的种子切成两半，含胚的一半种子在 MS 培养基上获得乃代幼苗，另外一半则用来 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 染色。经常人们会将胚乳和胚的表型放在一起进行比较，因为它们的基因型虽然相同，但是基因组倍性不同。

( 2 ) 对于根和叶的染色，则没有必要对种子进行消毒；当然种子也可以先在 70% 的乙醇中洗 30s，然后用无菌的去离子水洗三次。对于一些物种，如小麦和大麦，先将种子置于湿润的滤纸上 5℃ 暗培养 2~ 4 天，接着在 20~25℃ 的暗环境下萌发 5 天，然后在同样温度下每天 16 h 光照培养，5~7 天后收集根和叶片。这一方法优于胚乳染色，因为有些物种的种子（如小麦和大麦）对次氯酸钠非常敏感。

( 3 ) 根据样品的体积大小，分别将它们浸没在加有 β-葡萄糖醛酸酶反应液的 96 孔、24 孔或 6 孔板上。

( 4 ) 样品放在打开的平板上抽真空（71 mm 莱柱）10~15 min，37℃ 摇床上反应过夜。

( 5 ) 第二天，观察 β-葡萄糖醛酸酶染色后的样品。图 13. 1 是事例 2 中 T1 代转基因种子胚乳染色完成后所得的结果。

( 6 ) 转基因插入位点的估测：根据 T1 代转基因植株 β-葡萄糖醛酸酶活性的观测结果可以得出一个分离比。根据观测值与单基因孟德尔遗传理论值（表 13. 1 ) 的卡方分析结果，可以判定单个基因的插入位点数（表 13.2)。在事例 2 中，几代转基因植株中，83 个单株具有 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 活性，而 17 个单株没有（ 图 13.1 ），这一结果表明转基因插入位点应该是一个。尽管许多文献上均采用此种分析方法，但值得注意的是，这一方法得出的结果只是对转基因插入位点的一种估测 （ 见注2)。同样是事例 2 , 进一步的分子检测结果 （见 3.1 节中 “基于基因型的遗传分析”）却表明，事实上该次外源基因的独立的插入位点应该是 2 个，而不是 1 个 ，因此根据表型得出的结果是不准确的。所以，真正的遗传鉴定应该是基于对转基因后代基因型而并非是表型的调查结果分析所获得的。

2. 基于基因型的遗传分析

表 13. 1 和表 13. 3 分别列出了 1 个或 2 个基因插入到 1 个、2 个、3 个或 4 个位点时，自交一代后的子代分离群体中，按照孟德尔遗传规律分离的理论比值。乃代植株为研究对象，采用的分析方法为 PCR 检测或者点杂交等分子检测方法。由于采用分子手段对几代植株的基因型鉴定比表型鉴定更为昂贵和费工（见 3 .1 节 “转基因表型的分离”），因此，基于基因型的遗传分析方法一般很少采用，尽管基于表型的分析方法有种种局限 （见注2) 。当然，可能的情况下最好将两种方法结合在一起进行分析。下面我们将结合事例2 ，介绍此种分析方法的具体操作流程：

( 1 ) 转基因植株的培育和表型鉴定分离结果的统计按照3. 1 节中转基因表型的分离中步骤 2~5 进行。保证结果准确性的重要一步是，乃代植株不要选择以使所有植株存活，并可以用于后续的实验分析。因为抗生素或除草剂的筛选会杀死转基因沉默的个体，从而导致遗传分析的结果发生偏差（见注 2 ) 。在事例2 中，具有明显 β-葡萄糖醛酸酶活性的 83 粒 T1 代种子（图 13. 1) 应该是含有 β-葡萄糖醛酸酶基因的，因此无需进行进一步的分析。而 17 个不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的几代植株则应该利用分子检测手段作进一步的鉴定，以明确它们是因为 β-葡萄糖醛酸酶基因的沉默，还是确实不含有 β-葡萄糖醛酸酶基因而没有表现出 β-葡萄糖醛酸酶活性。

( 2 ) 收集 17 个不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的代植株的叶片样品，以及阴性对照（野生型植株）和经 PCR 检测的阳性对照样品，样品的长度应该与 1.5 ml 的微型离心管匹配。

( 3 ) 按照产品的使用说明用 DNA 提取试剂盒抽取叶片样品的基因组 DNA。

( 4 ) PCR 反应中应加入的 DNA 模板量根据各物种的基因组大小而定，25 μl PCR 反应体系中水稻基因组 DNA 的加入量通常为 25 ng，而大麦或者小麦则为 100~150 ng。

( 5 ) 每个 PCR 反应体系包括植物基因组 DNA，1x 的反应缓冲液（含 2.5 mmol/L MgCl2) ，250 μmol/L   dNTP，正、反引物各 0.4 μmol/L ( 如根据 β-葡萄糖醛酸酶基因设计），2 U Taq DNA 聚合酶。

( 6 ) PCR 的反应程序：DNA 样品先 95°C 变性 1 min；接着是 95℃ 变性 30s、60°C 退火 30s、72°C 延伸 1 min，共 30 个循环；循环结束后，72℃ 最后延伸 10 min。

( 7 ) PCR 反应产物（5~10 μl）用 1%~1.2% (m/V) 含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶进行电泳分析（每 100 ml 凝胶加入 5 μl 溴化乙锭，琼脂糖凝胶用 0.5X TBE 缓冲液加热溶解），电泳时电压为 80~100 V，时间约为 20 min。紫外灯下观察（图 13. 2) 到 17 个代检测样品中有 7 个单株含有葡萄糖醛酸酶基因却没有 β-葡萄糖醛酸酶活性（ 即 β-葡萄糖醛酸酶基因被沉默了）。

( 8 ) 可以利用植物本体单拷贝看家基因或者 RFLP 探针的引物重复步骤 5~7 对 DNA 样品进行质量鉴定，以确保它们能够成功地进行 PCR 扩增。通过对看家基因的扩增分析，结果表明从事例 2 中获得的 10 个样品可以进行 PCR 扩增（图 13. 2) 。

( 9 ) 计算转基因插入位点数：利用孟德尔遗传规律的理论值（表 13. 1 ) 可以对所获得的观察值进行卡方检测。事例 2 中，90 个 T1 代单株含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，而 10 个单株不含，根据卡方检测结果我们可以看出植物基因组中转基因的插入位点应该是两个，它们可以独立地自由分离（表 13.2) 。