1 .由长dsRNA引起的非特异性基因沉默
寻找哺乳动物细胞中存在RNAi的证据颇费了一番周折。
将较长的dsRNA（超过30个碱基对）转染几种特定脊髓动物细胞系统如小鼠的早期胚胎中，斑马鱼和中华仓鼠卵巢细胞中，能够诱发细胞内的RNAi现象，而在大部分脊髓动物的成体细胞中不存在类似于RNAi的机制，却引起了非特异的基因表达抑制。这种抑制可能是激活了细胞的病毒防御机制，导致细胞内干扰素产生增多的缘故。而在未分化的胚胎细胞中，这种防御病毒的机制存在缺陷。
较长的dsRNA引起哺乳动物的成体细胞发生非特异阻断基因表达，是通过以下两种机理进行的：
1）蛋白激酶PKR的激活 PKR的活化依赖dsRNA的长度，PKR的完全激活大约需80个核苷酸的dsRNA。激活的PKR使翻译起始因子eIF-2a磷酸化而失活，导致翻译抑制，进而所有蛋白质的合成受到抑制。
2）RNaseL的激活 较长的dsRNA也激活了2’,5’- AS (2’,5’- Oligoadenylate synthetase, 2’,5’-AS)，而2’,5’- AS又能活化细胞中处于潜伏状态的RNaseL，后者被活化后可非特异地切割mRNA。
以上两个结果最终导致细胞凋亡。
Tunschl研究组在试验中观察到，较长的dsRNA转入哺乳动物的成体细胞内还可以产生可重复利用且序列特异的siRNA。他们推断，dsRNA除能引起哺乳动物的成体细胞发生非特异阻断基因表达外，至少还应存在一种与之竞争利用dsRNA的途径，即同时发生了与其它生物种属一样的特异性降解靶mRNA的RNAi效应[12]，但哺乳动物细胞内并不存在放大扩增机制
[16]。
2 21nt的siRNA引起的特异性基因沉默
由于大于30nt的双链RNA能够非特异的阻断哺乳动物细胞的基因表达，RNAi在哺乳动物细胞中的应用受到限制。但德国马克斯.普朗克生物物理化学研究所的Tunschl等人的实验研究克服了这一障碍。他们利用少于
30nt的dsRNA不能激活PKR激酶的原理，将21nt大小的dsRNA转染进细胞，在有效降低靶mRNA和蛋白质水平的同时并没有激活细胞内的非特异性途径。他们合成了以表达荧光素酶的mRNA为靶基因的21nt的双链RNA，将其与表达质粒用脂质体共同转染到NIH3T3，COS-
7，Helas3和293细胞中，报告基因的表达被抑制了90%。由于报告基因的结果还不能完全说明细胞内的真实情况，于是又合成了细胞内源性基因
LaminA/C为靶基因的双链RNA，也获得了同样的抑制效果[17]。他们研究还发现，哺乳动物细胞内的siRNA的序列专一性要求非常严谨，具有很高的特异性，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果[18]。这对dsRNA的应用非常重要，它可以避免dsRNA同时对靶mRNA的同源mRNA的降解。