RNA干扰（RNAinterference，RNAi）基础知识(2)

1RNA i的发现
RNA i是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA （antisenseRNA ）的过程中发现的，由dsRNA 介导的同源RNA 降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA （senseRNA ）和反义RNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA 技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA 抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA 中污染了微量dsRNA 而引发，并将这一现象命名为RNA i。
此后dsRNA 介导的RNA i现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranional gene silencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNA i在不同物种的表现形式。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA 中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA 通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA （small interferingRNA ，siRNA ）引发RNA i。
2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA 能引发RNA i效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依赖的蛋白激酶(dsRNA -dependent protein kinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase，2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA （small hairpinRNA ，shRNA ）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNA i技术进行基因治疗研究奠定了基础。
2RNA i的应用
2.1RNA i在探索基因功能中的应用：人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在 RNA i技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNA i技术可以利用siRNA 或siRNA 表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA 表达文库构建方法的建立，使得利用RNA i技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。
2.2RNA i在基因治疗领域中的应用：RNA i作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNA i技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA 或shRNA 表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
3RNA i在整形外科领域的应用前景
已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNA i技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。
最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNA i干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。

瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA 剔除TGF-βII型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of lloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。
综上所述，RNA i技术不仅在黑素瘤、乳腺癌等恶性肿瘤基因治疗中有较好的应用前景，而且在肿瘤和瘢痕疙瘩治疗靶点的高通量筛选过程中有较高的应用价值。