一. 实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;
2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
二. 实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭(EB)未扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA含量成正比。
三、仪器和试剂
仪器: 微量移液器,电泳仪,电泳槽,微波炉
试剂: 琼脂糖:1.0%;电泳缓冲液(50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ,冰醋酸5.7ml , 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ,加蒸馏水至100ml ) EB:5 µl / 100 ml TBE
电泳材料:标准分子量核酸(DL2000)
四. 操作步骤
(1)制胶(以20 mL为例)
a. 称取0.2 g 琼脂糖,加入20 ml 的1XTAE缓冲液(pH 8.0),摇匀;
b. 微波炉加热,至琼脂糖完全溶解(要防止过热溢出三角瓶);
c.将制胶板放入制胶槽中,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)加入2ul EB后,混均匀,倒入其中,直至厚度为4~6 mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~ 45 min);
d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。
(2)点样
用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。
(3)电泳
打开电源开关,调节电压至3~5 V/cm(约100 V),可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,约30-40分钟后即可观察结果。
(4)观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上,打开紫外灯,可见到橙红色核酸条带,根据条带粗细,可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳,则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
五、实验结果
点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮,条带粗细均匀;条带没有出现两端粗中间细的情况
6月5日,11:00a.m. 美国中部夏令时间马萨诸塞州弗雷明汉——在ASMS2023上,生命科学分析技术制造商SCIEX推出了Intabio™ ZT系统,这是一个在单一平台上结合......
6月5日,11:00a.m. 美国中部夏令时间马萨诸塞州弗雷明汉——在ASMS2023上,生命科学分析技术制造商SCIEX推出了Intabio™ ZT系统,这是一个在单一平台上结合......
毛细管电泳具备如下优点:(1)高效塔板数目在105-106片/m间,当采用CGE时毛细管电泳色谱图,塔板数目可达107片/m以上;(2)快速一般在十几分钟内完成分离;(3)微量进样所需的样品体积为nL......
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,......
电泳电压一般100v到300V如果超过或低于这个范围就容易出现偏厚或偏薄有可能泳泳不上,特别注意电泳电压超过300V后就会击穿电泳漆。导致电泳漆过快老化......
分析测试百科网讯2020年11月16日-18日,慕尼黑上海分析生化展在上海新国际博览中心隆重召开。鲁美科斯携全自动测汞仪RA-915Lab、AriaDNA微芯片实时荧光定量PCR仪、高效毛细管电泳仪C......
2%的琼脂糖凝胶电泳跑多少时间合适看染料的位置就好了,怕时间太短你可以放回去继续跑嘛......
影响电泳迁移率的外界因素:①电场强度②溶液的pH值③溶液的离子强度④电渗现象影响电泳迁移率的内在因素:①质点所带净电荷的量②质点的大小和形状......
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过......
电泳法分离混合蛋白质的基本原理是根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法。电泳:在外电场的作用下,带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白......