常见问题 |
具体情况 |
可能的原因 |
处理办法 |
备注 |
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样品准备问题 |
菌培养不好或失败 |
抗性不对或菌已死 |
核对抗性，尽可能提供载体信息。 |
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或菌培养条件特殊 |
重新提供菌液，或提供2μg纯化质粒。 |
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质粒提不出 |
质粒拷贝数极低或 |
客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。 |
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培养方式不当 |
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质粒产量很低 |
低拷贝数质粒或 |
客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。 |
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培养方式不当 |
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自带质粒或已纯化PCR产物量极低 |
是否为电泳法定量， |
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。 |
测OD值法不可靠,电泳检测 |
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总量是否足够 |
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。 |
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测序出现双峰或信号中断 |
双峰 |
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复 |
用反向引物测互补链。 |
此类问题主要与样品有关 |
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质粒测序在插入序列中出现套峰 |
可能是样品非单克隆，挑其他测序。 |
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PCR产物测序中，某一点后序列变乱 |
可能是存在移码突变，这是正常的，也可以后测序。 |
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PCR产物中一个或多个位置有套峰 |
序列中存在突变，这是正常的，也可以后进行测序。 |
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PCR产物测序前部分双峰 |
引物二聚体污染或产物不纯，后测序。 |
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质粒测序时整个结果双峰 |
引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。 |
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质粒和PCR产物测序出现双峰 |
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。 |
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信号迅速衰减或中断 |
模板GC二级结构区后 |
难以得到好的测序结果，亚成较小的片段进行测序 |
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模板GT二级结构区后 |
测反向互补序列，AC结构不影响测序 |
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严重的重复结构 |
测反向互补序列 |
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模板特性决定的 |
根据具体情况决定 |
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信号极弱或无信号 |
模板质量差 |
重新提供菌液或纯化PCR产物 |
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质粒样品：引物不符 |
尽量提供载体详细信息，核查引物 |
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引物不适宜测序 |
测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议到载体上用通用引物进行测序 |
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质粒产量极低 |
客户自己提供2μg纯化好的质粒 |
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PCR产物定量极低 |
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化 |
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测序结果正常，与预期不符 |
找不到引物 |
质粒模板 |
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，位点离测序引物太近，长插入片段未测通。 |
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PCR模板 |
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经后进行测序。 |
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结果完全不对 |
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。 |
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