DNA测序技术（非同位素银染测序系统操作技术与T7DNA聚...

3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。

（二）超螺旋质粒DNA 的碱变性：

1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA 至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。

2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液，置于室温(25℃下）保温5分钟。

3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)涡旋混匀，使之中和。

4、加75ml无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70℃沉淀10分钟。

5、于12000g离心10分钟，弃去上清，用200ml预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml无离子水中。

（三）、测序反应：

1、引物和模板的退火：

（1）在一离心管中，混合如下几种试剂：

引物 约1-2pmol

5×T7 DNA 聚合酶测序反应缓冲液 2ml

DNA 约1mg

加ddH2O终体积至10ml 。

（2）将试管盖盖上后，65℃ 加热2分钟，然后在大约30分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65℃的水浴，使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至30℃以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4小时内使用。

2、标记反应

（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500个碱基以上），首先需要按1:5稀释标记混合物。如4ml 混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在 -20℃可使用数周。如果所要测定的序列小于30个碱基，可将标记缓冲液稀释15倍，同时，模板DNA 要高于0.5pmol。由于DNA 模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。

（2）用冰预冷的TE缓冲液按1:8稀释T7 DNA 聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60分钟。不得使用标记混合物、DTT溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。

（3）在已退火的引物 -模板混合物中，依次加入：

0.1mol/L DTT 1.0ml

标记混合物 2.0ml

[a-35P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ml

已稀释好的T7 DNA 聚合酶 2.0ml

混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5-10分钟。

如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP 混合物的效果优于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法与dGTP混合物的使用是相似的。

[注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。

2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100个碱基。

3、链终止反应：

（1）取4支eppendorf管分别标上G，A，T，C。

（2）每个管分别加入2.5ml G，A，T，C链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP和dITP混合物依据各自需要 选用。

（3）将eppendorf管预热至37℃ 1分钟。

（4）待标记反应完毕后，取3.5ml标记反应液至上述4支eppendorf管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37℃保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。

（5）继续保温3-5分钟（若使用dITP时，保温时间可延长至30分钟，对反应产物没有任何影响。

（6）在上述四管中各加入4ml终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电泳。用35S标记反应的样品可置于-20℃保存一周，此时样品只有极少量的降解。而32P标记的则需在当天电泳以免降解。

（四）测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80℃ 2分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2-3ml

（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影。

电泳完毕后，经32P或35S标记的产物可用对b-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。

1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心地揭下凝胶，准备下一步的处理。

2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15分钟，去除尿素。

3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。

4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X-光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X-光曝光盒中放射自显影。一般32P曝光过夜即可，而35S为2-3天。

5、曝光完毕后的X-光片即可冲洗，获得序列信息。将X光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分钟以上。取出X-光片干燥并读出序列。

[ 注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分钟，第二次 10分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。

2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X-光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。

3、曝光时间应根据所使用的同位素而定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。