[9].制作平板培养基：将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10ml，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15min左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24h后检查，如培养基没有长杂菌，即可用来培养微生物。
[10].无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的细菌培养箱中培养24~48h，以检查灭菌是否彻底。
2、细菌的复苏
[1].复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护及无菌条件下进行。
[2].启开菌种宜采用锯开法（锯开前用70%酒精棉消毒菌种管外壁）。用吸管将液体培养基0.3ml左右注入被启开的菌种安瓶中并吹打，使安瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。
[3].将上述菌悬液全部吸出，分别接种到固体斜面和液体培养管中，一般放置在37℃培养箱培养18~24h（具体接种方法见下面的实验介绍）。
[4].次日观察菌种的生长情况，如菌种未生长，应继续培养至72h。
[5].复苏后的菌种在传1~2代后使用。
[6].暂不启开的安瓶及复苏后需保藏的斜面应于4℃中保藏。
3、细菌的培养
[1].固体平板培养基培养
A.右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取大肠杆菌保存液少许。
B.左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的1/10），划线时接种环与平板表面成30~40º角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。
C.烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线；以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者班级，姓名，组别等，置37℃孵育培养24h后观察结果。
[2].液体培养基培养
无菌操作基本方法同前面的步骤。吸取10μl保存液，沿液体培养基的三角瓶瓶壁接近液体表面之管内壁轻轻将菌液加入液体培养基中（勿用力振荡），使细菌混入培养基内，塞好棉塞，用牛皮纸包扎好，置于37℃水浴摇床中200rpm培养，次日观察结果。
[3].斜面培养基接种法
A.左手持菌种管与培养基管，斜面皆向上，菌种管在外侧，右手如拿毛笔的姿势持接种环，将铂丝与欲进入试管的柄部通过火焰灭菌。
B.右手的小指与掌心夹下培养基管棉塞，第四指与小指夹下菌种管棉塞，管口通过火焰。
C.接种环伸入菌种管，沾取少许菌种。
D.接种环伸入培养基管，在斜面上蜿蜒划线。注意沾有菌种的接种环不可碰管口与其它地方。
E.管口再通过火焰，并将棉塞塞于原来的试管。
F.接种环再灭菌。
4、细菌的保种
[1].短期固体培养基保藏（斜面试管培养基保存法）：
按照上面的方法划线接种于斜面试管培养基中，37℃过夜培养。将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。定期进行传代培养、再存放。
[2].长期甘油冷冻保藏：
A.在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，
在乙醇－干冰或液氮中冻结后再转至-70℃长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37℃过夜。
B.在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2ml
LB的无菌试管内，再加入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库。
5、感受态细菌的制备（CaCl2转化法）
[1].划线复壮宿主菌37℃过夜。挑一单菌落于30ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇至OD600=0.2~0.4，取出置于冰上10~15min。
[2].取1mL菌液于灭菌的1.5ml离心管中。4℃，5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl2，重悬菌体，置冰浴15~30min。
[3].4 ℃5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体。放置于4℃用于转化，若不用则加30%甘油置-70℃备存。
注意事项：
[1].灭菌后的所有操作都应该在无菌的情况下进行。
[2].配制药品、培养基等均用超纯水。