星形胶质细胞来源于2天的大鼠。断头后的大鼠大脑收集在含有11mM 碳酸氢钠，71mM葡萄糖和1%抗菌素的DMEM溶液中。移除脑膜，血管和白质。大脑皮层用机械分裂法进行匀浆，然后将细胞悬液经230μm，104μm 和73.3μm孔的铁丝网依次过滤。然后用700g 速度10分钟离心收集细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM重悬细胞。最后，以2.0×105细胞/cm2将细胞接种到培养皿中，将培养皿放入37°C 5%CO2 湿润培养箱中进行培养。7天后更换培养液，10天左右细胞能铺满培养皿。
选用2天的大鼠进行星形胶质细胞培养，而且培养皿没有经过多聚赖氨酸预处理（因为在没有多聚赖氨酸的情况下，神经元细胞贴壁能力非常弱），可以最大程度的减少皮质神经元的污染。
与神经元相似，星形胶质细胞体外培养5、10、20天可用来评估与年龄相关的细胞形态变化。