高通量测序锁定病原体“命门”

《科学》杂志的历史上，刊载过一篇沉重的学术文章。2014年一篇关于通过基因组学手段监测埃博拉病毒的起源和传播的论文，在刊登时已有6名研究人员因感染埃博拉而死亡。

“对埃博拉病毒的研究和控制是高通量测序技术（二代测序技术）全面应用的首次‘实战’。”日前，在由中国医学科学院、北京协和医学院主办的第二届感染性疾病精准医学高峰论坛上，参加过与埃博拉病毒一线作战的研究人员，对中国团队与埃博拉病毒“作战”的战略战术进行了揭秘。中国科学院武汉病毒研究所研究员刘翟表示，病原体能使人类群体性致病甚至致死，二代测序技术及宏基因组学能帮助人类追溯病原体、捕捉放大它们在分子水平上的变化、锁定病原体“命门”，最终赢得“人毒之战”“人菌之战”。

测准遗传物质 新策略抓住病毒“七寸”

在2014西非埃博拉病毒爆发期间，美国的团队最初断言病毒可能在加速进化。刘翟回忆，这一发现在当时是一个“面临强敌”的信号，它意味着传统的检测防治方法或许失效，如果埃博拉病毒是迅速变化且致命性叠加的致病原，其危险性将比人类最初认知的更高。

“病毒在短时间内迅速变化并不符合进化逻辑。”刘翟说，要改变美国团队的结论，中国团队需要提供更多的事实和数据。

中国团队在非期间检测了大量临床样本，对175株埃博拉病毒进行了全基因组测序。“利用二代测序技术，很少的变异也能被‘觉察’到。”刘翟说。

二代测序的应用不是简单地将病例样本中的基因提取出来进行比对。全基因组的遗传信息繁杂而海量，测定不只包括量的叠加，还包括相互作用和影响，即测定病毒在宿主体内的进化，以体现宿主和病毒的基因组之间的相互作用与关联。宏基因组学的研究基础是人和病毒的遗传物质混在“一个篮子里”，这增加了研究工作难度；此外，由于埃博拉病毒是RNA病毒，共同提取的将是人类遗传物质中的RNA，RNA的复杂程度也加大了研究难度……

为此，研究团队设计开发了埃博拉病毒基因组的新测序策略——扩增子深度测序技术，并开发了一套全新的生物信息学分析流程。“我们设计了标准质粒进行方法验证，将测序方法的假阳性率控制在千分之一以下。”刘翟介绍，考虑到在宿主中病毒的痕量，团队还在方法的敏感性上取得了突破，做到低浓度样本下仍能探测到位点变化。

团队对于样本的生物信息学分析，在病毒暴发过程中第一次锁定了埃博拉病毒的“进攻线路图”。刘翟展示的病毒地理学联络图，显示与西非的城市热度和交通枢纽相一致。

除了进攻路线，团队还揭示了埃博拉病毒基于自身的“战术变化”——在宿主内，埃博拉病毒曾经产生了710个单核苷酸变异位点，也维持着最保守基因的不变。保守基因的发现相当于抓到了病毒的“七寸”。刘翟逆向思维，“最保守基因的突变对于病毒大都有害，可以作为最有效的抗病毒靶点。”

预判威胁 防患SARS“东山再起”

同类技术在SARS（严重急性呼吸综合征）同族病毒的发现与监控中，也发挥了居功至伟的作用。

几年前，广东省四个猪场出现了小猪仔急性腹泻死亡的疫情，两万多头小猪出生后6天之内迅速死亡。这引起了军事医学科学院研究员童贻刚的注意，“近年来发生的重大传染病疫情大部分由动物病毒跨种传播引起，此次疫情发生地距离SARS发源地小于100公里。我们通过遗传物质的测序确定致病病毒也是一类冠状病毒。”病毒类型、发生地点以及近年规律都不同程度地亮起“警报”。

《变形金刚》里的威震天被消灭多次，却会在宇宙的尽头休整，一旦人们放松就伺机重生。SARS冠状病毒在2003年造成了全球性的恐慌之后，会不会上演威震天的戏码？

为了回答新发现病毒与SARS病毒同源性如何、如何传播、感染人类能力等问题，多个科研机构组成的团队共同展开研究，基于二代测序技术进行病毒分离鉴定、动物感染回归实验、回顾性检测等工作。团队将新病毒命名为猪急性腹泻综合征（SADS）冠状病毒。

“通过新旧病毒的比对，我们发现它与SARS病毒在外壳蛋白上有86%的相似度。”童贻刚说，这说明感染蛋白可能发生了变化。也就是说，病毒获准进入机体完成感染的“敲门砖”变了。

随后，科研团队用已确定的病毒特征为“钓饵”，在广东地区近几年收集的蝙蝠标本中，寻找是否有蝙蝠携带关联病毒。在几百个样本中，团队获得了58份结果为阳性的样本，大部分来自中华菊头蝠（注：科学家们此前证实SARS病毒正是来源于中华菊头蝠）。团队进行了病毒传播路线图的绘制，发现发病的4个猪场并没有相互传染，很有可能是通过蝙蝠的粪便传播。

“我们对猪场的饲养员进行了病原体检测，没有发现人员感染。”童贻刚说，但是对于病毒组学的研究表明，该类病毒是有能力感染人类的。病毒对人体的作用，以及激发人体内的免疫反应和对病毒表达的调控，仍是一个严峻课题，有待探索。

初入临床 颠覆对罕见菌致病性认识

除了在威胁全球的重大传染病疫情的防控中发挥重要作用，二代测序技术在日常临床中的应用将有助于“认新”“控药”“测毒”等，即诊断新型病原体、确定病毒的抗药性以防止抗生素滥用、测定不同流行病的源头等。

“近一年仅我们团队在诊断病历中就发现8例诺卡氏菌病例。而在教科书中，这类菌被描述为罕见菌。”复旦大学附属中山医院感染病科主任胡必杰教授说，过往资料表明，人类对这种菌的致病性认识非常有限。

胡必杰认为，现实与教科书中的反差是由于此前的手段难以帮助医生诊断出这种致病菌。“它非常细小，在同样的培养条件下，很难被分离出来，而且需要7天才会培养到可见。普通培养一般3天。”胡必杰说，菌体的“个性”使得凭经验在病例中发现它相对困难。

二代测序技术让它们重新回到医生的诊断“视野”。胡必杰表示，通过对宏基因组进行测序，可无差别地检测各种病原体，突破了传统检测手段的限制，大大提高了病原学检出的敏感性，这种之前难以被检出的病原体也“露了馅”。24小时内诊断也能为急性感染的判断和对症迅速给出参考。

由于设备要求高、技术门槛高、平台构建需要大量资金投入，目前在临床应用领域，二代测序只是“初入”，只有条件好、资金充足的少量三甲医院在建相关平台、培养和储备技术人员。此外，不同样本的提取如何才能高效准确、遗传物质的提取质量标准如何，都尚待完善。中国食品药品检定研究院的双盲测试表明，对于同样的已知基因，不同测序公司的结果也并非完全一致。

中国工程院副院长、中国医学科学院、北京协和医学院院校长王辰院士呼吁：感染性（传染性）疾病危害严重，精准诊断是实现其精准防控的前提。针对感染这一重大医学问题，需要将基因检测与传统检测相结合，加快将最新的生物科技转化成先进生产力，应用于临床感染精准诊疗。