Subvisible Particles in IVIg Formulations Activate Complement in Human Serum
IVIg配方中的亚可见颗粒可活化人血清中的补体
当静脉注射时，各种颗粒和纳米药物会激活补体，可能导致输液反应和其他药物不良反应。颗粒在治疗蛋白的配方中，由于运输、处理和给病人的治疗过程中产生的应力形成。在本研究中，IVIg溶液被储存在多种类型的小瓶和预填充的注射器中，并暴露在搅拌和冻融应力下产生颗粒。将应激样本加入人血清中，以确定这些颗粒是否激活补体。大小在2到10微米的亚可见IVIg颗粒其激活补体的方式与颗粒数量呈现出线性关系，而在较大粒子(>10微米)的剂量和补体激活之间几乎没有相关性。通过亚可见颗粒IVIg激活补体是另一种途径，如补体级联因子Bb的释放和无C4a生成的过敏性毒素C3a和C5a。亚可见颗粒的数量和形态取决于所施加的应力、配方和容器材料。但2-
10微米大小的微粒激活人血清补体的能力仅取决于微粒浓度。
介绍
治疗性蛋白质为多种人类疾病提供有效的治疗。然而，在小部分患者中，这些药物的安全性和有效性受到不良药物反应(ADRs)的影响，包括不良免疫反应、输液反应、过敏反应，甚至死亡。有些ADR很常见。例如，在大约一半的第一次接触利妥昔单抗的b细胞恶性肿瘤的患者的过敏反应中，14.5%的患者报告有严重的输液反应，12.3%的患者对anti-TNF-a抗体英夫利昔单抗有输液反应。过敏反应，超敏反应和增加(不希望的)抗体反应都可由补体激活引起。补体通常作为一种对抗病毒和微生物挑战的生物防御机制被激活，但是静脉给药的纳米颗粒也可以激活补体级联。一旦补体级联被激活，就会产生强烈的促炎和过敏性反应。这些反应的强度主要是由补体系统中产生的2种过敏性蛋白C3a和C5a的程度所驱动的。这两种信号分子能够引起血管扩张，调节细胞因子的产生，引起组胺的释放和氧化爆发，并作为天然免疫细胞趋化的信号。
治疗性蛋白在生产、运输、储存和给患者使用过程中容易聚集形成可溶性低聚体和亚可见颗粒。这些聚集物是不良免疫反应的危险因素，可导致治疗效果的丧失和其他不良反应。蛋白质的聚集通常是由蛋白质暴露的界面相互作用引起的，例如空气-水、容器-水和冰水界面。这些界面应力可以通过处理放大。例如，在硅油润滑的注射器中发现的容器水界面上的蛋白质的聚集可以通过搅拌大大加速，而治疗性蛋白质配方中的颗粒水平可以通过冻融显著增加。我们假设，像一些纳米药物一样，蛋白质配方处理产生的颗粒可能能够激活补体。为了验证这一假设，我们首先进行了加速稳定性实验，通过使多克隆抗体配方(静脉免疫球蛋白，IVIg)在多种类型的小瓶中受到冷冻或在多种类型的预填充注射器中受到搅拌引起的压力，在多克隆抗体配方中产生颗粒。然后，我们测试了这些处理诱导的颗粒添加到人类血清样本中是否能够激活补体。使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定补体激活程度，以量化补体促炎特性的2个关键信号分子C3a和C5a的水平。此外，我们测定了C4a和Bb的水平，以探索哪些补体通路可能被激活。C4a的产生是补体通过经典或凝集素途径激活的标志，而Bb的产生则表明补体通过其它途径激活。
材料与方法
使用的材料是USP级或更高。静脉注射免疫球蛋白(丙种球蛋白;GAMMAGARD LIQUID®，Shire US
Inc.， Lexington, MA)是从科罗拉多大学博尔德分校的Wardenburg药房购买的。购自Sigma Aldrich公司(St.
Louis, MO)的化学品包括磷酸一钠、磷酸二钠和甘氨酸。从Fisher
Scientific(Waltham，MA)购买的化学品包括聚山梨酯20 (PS20, Tween
20™，N.F.)10倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)和HyClone™注射水。硅化玻璃注射器为BD催眠SCF 1 mL长27G1/2 (BD
Medical-Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ)。SiOPlas™注射器(1ml)
(SiO2 Medical Products, Inc.， Auburn,
AL)由环烯烃聚合物(COP)注射器筒组成，其内部表面涂有硅基屏障涂层系统和有机硅润滑油，均采用等离子体增强化学气相沉积技术。SiOPlas™小瓶(6ml)由COP组成，在小瓶内部涂覆硅基屏障涂层系统。6
mL Ompi EZ-fill®硼硅玻璃小瓶(Schott, AG)由SiO2 Medical Products, Inc. (Auburn,
AL)提供。
蛋白配方
使用前，IVIg的蛋白浓度为1 mg/mL，用pH 7.4的PBS配制，或用pH 4.25的250mm甘氨酸配制，即0.02% (v/v)
PS20配制。为了去除任何已存在的颗粒，将含有100 mg/mL免疫球蛋白G在250 mM甘氨酸中的GAMMAGARD LIQUID®样品，在4°C, 20000 G离心20分钟，上清液作为储存液。将IVIg原液用0.02% (v/v)的PS20稀释1:100至0.22微米过滤的PBS pH 7.4或250 mM甘氨酸pH 4.25，得到最终浓度为1 mg/mL的IVIg。
对IVIg配方进行搅拌加速应力试验
将IVIg配置至0.02% (v/v) PS20与pH 4.25，250
mM甘氨酸溶液中。填充入注射器，使液体和塞子之间有一个均匀的4毫米的空隙(达维勒制药包装公司，Pennsauken,
NJ)。这些注射器在室温下从头到尾旋转10天，每旋转一次，顶空间隙中的气泡就会从注射器的一端移动到另一端。在一些被测试的注射器中，气泡会卡在注射器的一端，并且随着注射器的旋转而无法移动。这些注射器被排除在外，不参与分析。经过10天的端到端旋转后，使用自动注射泵以150mm
/min的速度从注射器中通过针头排出每种制剂，并在预先准备的聚丙烯管中收集样品，检测亚可见颗粒浓度和补体活化能力。
将PBS中填充1mg /mL
IVIg的样品注入到另一组硅化玻璃和SiOPlas™注射器。这些注射器被水平放置在轨道摇床上，在室温下摇一夜。摇动后，使用自动注射泵以150mm
/min的速度将配方液从注射器中通过针头排出，收集在预浸的聚丙烯管中，并检测亚可见颗粒浓度和补体活化能力。