PCR在临床检验中的应用（二）

     呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

    循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

    PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。