NK细胞培养与优化

  因NK细胞是一种比较难培养的细胞。培养过程会涉及很多问题，如：细胞接种密度如何？NK细胞有哪些特性？NK细胞具有哪些形态特征？......

       使用的NK细胞培养套装为无饲养层细胞体外扩增技术，以外周血单个核细胞（PBMC）为起始种子细胞，结合多种细胞因子的诱导和刺激，实现NK细胞体外特异性的高效扩增。具有适用性强，对种子细胞的来源选择性好，不需包被；无饲养层培养工艺，简化操作，提高产品安全性；使用多种细胞因子及小分子物质联合刺激，充分活化效应细胞等技术优势。

       试剂：NK细胞培养套装；

       耗材：培养瓶；细胞培养袋；移液管；采血袋等。

       操作过程：

       D0：白细胞层分离培养及诱导

       脐血经病毒检测合格后，送入实验室中。取70ml脐血，按常规的血浆及PBMC分离方法分离获得血浆和白细胞层。白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养瓶中。加入诱导培养基、因子及灭活血浆，放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中培养。

       注意事项：

       1、脐血尽可能采集新鲜血液，否则容易凝血；

       2、需注意Ficoll的温度，否则易混杂较多红细胞；

       3、注意离心的升降速设置，否则无法获得白细胞层。

       D2：显微镜下观察细胞生长状况：

       细胞经诱导刺激，有明显的半贴壁聚团生长，部分细胞聚团悬浮生长。细胞略有增殖，增殖不明显。

       20*物镜

       D3：细胞观察并补充诱导培养基

       细胞经过二氧化碳培养箱培养，半悬浮贴壁较D2增多，细胞聚团更为明显。

       注意事项：前3天不能剧烈晃动细胞，避免干扰细胞成团。

       10*物镜

       D5：细胞观察并补充增殖培养基

       经过两天的培养，半悬浮贴壁的细胞已开始悬浮于培养基中，培养基颜色变黄。细胞计数为1.1*106/ml，补充增殖培养基，刺激NK细胞增殖。

       10*物镜

       D7：细胞观察并补充增殖培养基

      培养基颜色变黄，显微镜下可明显看到细胞聚团增大。细胞计数为2.0*106/ml，补充增殖培养基，调整细胞密度，刺激NK细胞增殖。细胞转移至培养袋中培养。略微吹打细胞，使细胞团略微分散。轻晃培养袋，使细胞分散培养。

       10*物镜

       D9：细胞观察并补充增殖培养基

       培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已基本分散生长。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

       10*物镜

       D11：细胞观察并补充增殖培养基

       培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在二氧化碳培养箱中观察形态，发现细胞已呈不规则形态，部分细胞有触角伸出。细胞计数为1.7*106/ml，补充培养基。

       10*物镜                                                            

       40*物镜

       D12：细胞观察并补充增殖培养基（本次非常规补液）

       培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，细胞形态与D11基本类似，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

       流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为82.74%

       10*物镜                                                            

       40*物镜

       D12-NK细胞流式检测结果

       D14：细胞检测

       培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为2.0*106/ml。

       流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为90.98%

       10*物镜                                                          

       40*物镜

       D14-NK细胞流式检测结果

       (一)X-VIVO无血清造血细胞培养基

       这个系列是属于化学成分限定培养基，为包括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、外周血淋巴细胞(PBL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在内的多种细胞提供营养完整和平衡的环境。此类培养基不包含任何外源性生长因子、人工促进细胞增殖的物质或未定义的补充物。它们不含任何蛋白激酶C刺激因子，适用于研究人类和小鼠淋巴细胞激活中的第二信使系统。