DNA复制叉稳定机制研究

　　解开50年谜题

　　“DNA复制错误主要来自DNA复制叉的不稳定。”孔道春对《中国科学报》说，“揭示checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心分子机制，找到DNA复制叉不稳定的原因，人们就可以有的放矢，在疾病筛查、靶向药物开发方面做很多工作。甚至可以在增强DNA稳定性方面有所作为，如果能让DNA复制叉更稳定，就有可能延长人类（包括其他生命体）的寿命。”

　　孔道春解释说，DNA复制叉主要由两部分构成，Y字型的DNA结构和DNA复制体。DNA复制体包含一系列与复制相关的蛋白质及蛋白质复合物，其中，最重要的是打开双链DNA模板的CMG解旋酶复合物，以及进行新生链DNA合成的DNA聚合酶。

　　“生命科学领域有很多待解谜题，而细胞周期检验点调控维持停顿复制叉稳定机制，是该领域的核心谜题之一。”孔道春说，“正常移动的DNA复制叉是相对稳定的，DNA复制体中的CMG解旋酶与DNA聚合酶在物理及生化功能上紧密偶联。当DNA复制叉遭遇复制障碍停顿下来时，停顿的DNA复制叉被证明是不稳定的，倾向于垮塌。”

　　拉开机制研究帷幕

　　上个世纪60年代末，科学家在裂殖酵母里筛选到了一株突变株，命名为rad3-136。很快，研究人员发现，rad3-136突变株对羟基脲 (HU抑制dNTPs合成，导致DNA复制叉停顿）高度敏感。至此，真核细胞维持停顿DNA复制叉稳定的机制研究拉开了序幕。

　　1988年，Rad3及相关蛋白介导的细胞调控被科学家命名为checkpoint调控,Rad3被归类为ATR激酶。

　　过去50年，前后上千个实验室，用两代人的时间，发表了上万篇研究文章，证明checkpoint是维持停顿DNA复制叉稳定的必需细胞调控。在checkpoint缺失或缺陷的细胞，停顿的DNA复制叉发生垮塌，导致DNA复制不能完成，及基因组的极度不稳定。

　　但在试图阐明checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的机制研究方面，科学家碰到了极大阻力。阻力主要来自于checkpoint调控的靶蛋白极难被确定，已发表文章的结论也互相矛盾，导致checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的核心机制长期难以确定。

　　阐明核心机制

　　通过大规模的遗传筛选，孔道春实验室发现，复制解旋酶CMG复合体的一个亚基Cdc45的突变，能极大降低(600~3000倍)checkpoint通路缺陷细胞对HU的敏感性。

　　“这暗示Cdc45或CMG复合体可能被checkpoint调控。”孔道春说，“通过一系列遗传及生化分析，我们发现DNA复制叉停顿后，Cds1Chk2同时磷酸化Cdc45亚基上的三个丝氨酸残基。这三个丝氨酸残基的磷酸化导致CMG复制解旋酶活性深度降低。CMG复制解旋酶活性的降低使得它不能脱离停顿复制叉，不能与被阻挡的DNA聚合酶分开。这样，停顿的DNA复制体及复制叉的生化完整性得到了维持，从而阻止了停顿DNA复制叉的垮塌。”

　　稳定停顿复制叉机制示意图。

　　 “停顿DNA复制叉里的复制解旋酶与DNA聚合酶倾向于分开关联到两件事情，一是DNA复制体或DNA复制叉的基本生化特性；二是正常细胞生长过程中导致复制叉停顿的基本原因。” 该论文共同第一作者刘阳告诉《中国科学报》，“DNA二级结构导致的复制叉停顿是一个经常发生的生物事件。在前导链或后随链的DNA模板上，如果有碱基损伤（每个人细胞每天有约105级别的这类损伤）或化学修饰，也会阻挡DNA聚合酶并导致复制叉停顿。当DNA聚合酶被阻挡后，CMG解旋酶还要往前移动，这样就会导致CMG解旋酶与DNA聚合酶物理上的分开，导致复制叉垮塌。”

　　真核细胞 DNA 复制叉及 S 期细胞周期检验点。

　　经过不懈努力，checkpoint调控维持停顿DNA复制叉稳定的核心机制最终得以阐明。即,停顿复制叉不稳定、倾向于垮塌的根本原因是当DNA聚合酶被阻挡后，复制解旋酶与DNA聚合酶倾向于分开。同时checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心机制是:降低复制解旋酶的活性，阻止复制解旋酶脱离复制叉或DNA聚合酶，维持两者之间在物理及生化功能上的紧密偶联，从而维持停顿复制叉稳定，并保持它的生物学功能。

　　“找到问题，找出问题的原因，往往离解决问题就不远了，希望这些研究能让人们离战胜癌症等重大疾病更近一些。”孔道春说。