5000bp！单分子测序读长再次升级

　　PacBio RS单分子测序在发布时就以其超长的读长引起研究者的极大兴趣。在不到一年的时间里，随着年初C2试剂的升级，Pacbio RS的平均读长达到了3000bp，并迅速在测序的各个领域，特别是De novo中发挥了巨大的读长优势。Pacific Biosciences公司在11月6日正式发布新的超长测序试剂：XL系列。该试剂将主要针对De novo应用，平均读长将达到5000bp，其中5%的读长将超过13000bp，最长超过20000bp。美国冷泉港实验室前期试用于水稻基因组的组装，得到9倍覆盖率的长片段读序中50%在4800bp以上，大大提高了其通过NGS mate-pair拼接的程度。相信随着该新试剂的正式全面投入使用，将会对现有基因组的完善带来更大的突破。

　　对于研究者所关心的一些问题，我们也联系了Pacific Biosciences公司的技术支持，并一一做了解答。

　　问：XL试剂有哪些更新?

　　答：XL 试剂采用了新的DNA聚合酶，合成速度更快，能够获得超长的读长，非常适合如De novo这样的应用。目前XL试剂可以获得平均5000bp的读长，5%的读长可以超过13000bp。不仅如此，XL试剂中的DNA聚合酶采用了热启动合成方式。这样就可以检测到在文库接头(adaptor)附近的序列，从而获得更长的读长。在非热启动方式下，合成反应开始的大约1000-2000bp 的碱基由于反应太快来不及被检测到，而热启动方式可以使检测器在合成起始时就可以很快的检测到碱基信号。

　　问：新试剂的升级是否需要改变现有的实验流程，如建库的方法?

　　答：不需要。XL试剂适用于构建10kb以上的模板库，我们之前已经有详细的protocol用于构建这样的模板库，所以用户只需要按照实验流程进行操作，换用新的试剂而已。

　　问：XL试剂最主要适合于哪些应用?

　　答：XL试剂在研发时主要用于de novo组装时产生长的读长，与PacBio 的CCS(环形比对读序)或用户已有的二代测序的组装数据进行混合拼接，加速完成完整基因组。厂家会随试剂附详细的XL试剂的应用说明。

　　问：是否可以用XL试剂进行碱基修饰和motif分析?

　　答：可以!XL试剂读序数据完全可以应用于碱基修饰测定。这也是PacBio RS第三代测序不同与其它测序系统独特的应用，最新版软件可以自动识别6- m A，4- m C和Tet转换的5-mC并进行甲基转移酶识别motif分析。PacBio在这方面一直在加紧开发完善相关配套数据库和软件，以不断增加更多软件能够自动识别判定的碱基修饰种类和motif分析。PacBio跟New England Biolabs合作关于细菌甲基化组的研究报道已在十月的《核酸研究》上发表(http://nar.oxfordjournals.org /content/early/2012/10/02/nar.gks891.full )， 不仅可以在基因组水平上研究甲基化图谱，还可以精确研究对应的甲基转移酶及其识别的motif。

　　问：XL试剂的升级是否需要硬件升级?是否需要额外的费用?

　　答：不需要硬件升级和额外费用!从PacBio去年二季度正式推出第三代测序系统至今，PacBio在不断提升测序品质和性能的同时都保持着仪器系统的一致性和兼容性，让用户免费得到各项升级，及时便捷地使用到第三代测序最新的技术和成果。

　　问：XL试剂是否会取代C2试剂?

　　答：XL 试剂是作为C2试剂的补充，主要针对诸如De novo组装这样需要超长读长的应用，超长读长能够确定变异的单倍体型，跨越长的各级重复区域，解析转录本可变剪切及拼接，大大提高解读复杂基因组和转录组的能力。而现有的C2试剂可以针对不同应用需求制备不同长度(250bp-10kb)的文库，二者并不冲突。因此，XL并不会取代现有的C2试剂。而正式的C3试剂(C2的升级版)预计会在明年推出。

　　问：使用C2试剂，系统可以记录单个90分钟时长的movie，或者两个45分钟时长的movie，那么XL试剂呢?

　　答：使用XL试剂可以记录单个120分钟时长的movie，或者两个55分钟时长的movie。

　　在此，我们已经初步了解了Pacific Biosciences公司即将发布的XL试剂升级的一些信息。PacBio公司Dr. Korlach也将在11月8日美国旧金山的ASHG (American Society for Human Genetics ) 年会上介绍该最新产品。同时，PacBio RS第三代测序用户如加州大学戴维斯分校的Dr. Paul Hagerman，斯坦福大学的Dr. Hagen Tilgner ，犹他州大学的Dr. David Witherspoon 等也将在该会议上交流第三代测序在脆性X染色体综合症，真核转录组分析，人的激活的LINE-1元件的动态扫描 (Mobile-Element Scanning )等应用中的最新进展和成果。我们会跟踪更多详细的内容，后续报道。