专家指南：如何开展基因表达研究（一）

　　众所周知，在不同的情况下，在不同的组织中，基因表达的水平也不同。如今，研究人员可利用多种技术来追踪基因表达水平的差异，如定量 PCR、芯片或测序。《Genome Technology》杂志这一次请来了几位科学家，让他们分享一下应如何选择这些技术。此外，研究人员也谈到了解决质量控制和数据分析的问题，以及如何验证基因表达研究的发现。

　　Q1：您如何评估哪种方法(芯片、定量PCR或测序)最适合基因表达研究?

　　Gary Hardiman(加州大学圣地亚哥分校)

　　答案在很大程度上取决于研究的目的。传统的qPCR最适合于少量目标和大量样品。芯片和RNA-seq最适合于整体的转录谱分析。芯片和RNA-seq之间的选择在于成本、数据处理的轻松程度以及检测灵敏度。

　　芯片实验的优势在于它们很快，相对廉价，且数据存储和处理较为轻松。在很短的时间内可生成两个样品之间差异表达基因的列表，并用于指导通路、基因本体、网络/互作组的分析，为两个样品之间的生物学差异提供线索。这也可以通过测序来实现，但过程稍微复杂一些。如果要研究选择性剪接，那么无疑要选择测序。

　　芯片也面临一些问题，包括近缘物种的交叉杂交，杂交动力学不好以及低丰度转录本的灵敏度差，无法区别目的基因和假基因。这些都会导致噪音数据。

　　商业化的芯片的缺点在于不能“与时俱进”，依赖于12个月或之前的基因组版本，有时注释也不是最新的。这可能导致探针内容不再相关。此外，芯片也可能漏掉与特定研究相关的重要探针。人和小鼠的基因组芯片不会有很大的问题，但其他物种(如斑马鱼)可能会。

　　高通量测序则没有以上这些限制。最终结果是一系列序列标签，可定位到转录本上。测序是一个有序的过程，不存在芯片技术所固有的噪音，因此产生很少量真正的hits。而另一方面，芯片依赖结合的能量学，而少量转录本会被非特异杂交所冲垮，因此未检测到。

　　大规模并行测序无疑将取代DNA芯片技术，来监控转录组的变化。然而，这些实验的成本以及分析实验的计算机要求让测序不如芯片技术那么普及，但随着测序仪产量更高，智能条形码的实施以及可靠分析工具的出现，这将迅速改变。也就是说，如果现在要发现两个样品之间差异表达的基因，我还是会选芯片。

　　Chris Harrington(俄勒冈健康与科学大学)

　　为了确定哪种基因表达谱分析技术适合特定研究，我们会咨询研究人员，考虑几件不同的事情。整个研究的重点和实验的具体目标是什么?是否要测定特定基因或网络如何变化?或者要探索整体的表达模式?非编码RNA如何?这是否是个临床研究，对样品量要求很高?我们利用这些信息来指导平台和操作步骤的选择。如果研究问题只是集中在少量通路或细胞功能，或者可通过芯片杂交检测到的变化来回答，那么qPCR或芯片就够了，也很经济。

　　另一个问题是实验可用的RNA量有多少，它的质量如何?目前，当总RNA起始量低于50 ng时，我们仍然借助于芯片和qPCR来开展表达谱分析，但我们预计少量RNA很快也能开展RNA-seq。

　　最后一个问题围绕着数据分析的计划和资源。qPCR和芯片数据已有可靠且易用的分析软件，但RNA-seq分析对大部分研究人员来说仍是个挑战。在我们建议一种具体的技术方法之前，我们尝试让研究人员了解有效的数据分析需要什么，以及所需的资源和/或合作者。

　　总的来说，我们会与研究人员共同确定哪种基因表达技术最能满足他们的特定目标，适合他们的预算，并处理他们所有的RNA量和类型。如果RNA、预算或数据分析资源有限，我们往往会引导研究人员开展芯片或qPCR。

　　Craig Praul(宾夕法尼亚州立大学)

　　实验的目标和成本指导了方法的选择。就所分析的基因数量和样品数量而言，这三种方法占据了不同的实验空间。新一代测序和芯片显然适合基因组范围的表达分析，而定量PCR在单次实验可评估的基因数量上要有限得多。样品数量也是一个重要的考虑因素。如果大量样品需要分析，那么新一代测序可能成本太高，而芯片实验的花费大约在1/2至1/3。如果目的基因的数量有限，那么定量PCR是分析大量样品的经济高效方法。

　　最后，如果发现新颖转录本或剪接变体是基因表达研究的目标之一，那么新一代测序是唯一选择。

　　Ralph Schlapbach(瑞士联邦理工学院)

　　分析技术的选择是基于研究项目需求的深度分析、研究小组的偏好以及现有的知识和数据。

　　根据所需的信息水平来解决一个特定的研究问题，选择最精确、最具成本效益，也最节省时间的方法。目前有多种新一代测序技术(HiSeq、 MiSeq、SOLiD、罗氏/454、Ion Proton和PGM、PacBio RS)和芯片平台(Affymetrix和Atlas芯片、安捷伦芯片)可供选择，我们可以通过预实验来确定最适合的技术。

　　如果准确定量、高灵敏度最重要，那么我们建议使用新一代测序。对于研究无参考基因组的物种或对表达的基因序列不了解的科学家，我们建议de novo转录组测序。同时，我们也对非编码RNA的分析很感兴趣，对于此，其他方法都不能以测序的成本和速度来提供数据。若研究目标可通过提供基因水平的表达数据来实现，那么许多研究人员仍然会选择芯片，因为它们在相当短的时间内产生了与现有研究兼容的数据，且成本较低。

　　另一个考虑是基于样品量和样品的珍贵程度。如果只有极少量的材料，我们会越来越多地使用新一代测序来生成数据，因为现在出现了更多适用于低起始量材料的操作步骤。不过，在某些情况下，我们为安全起见，还是会选择使用芯片，它产生了较少但仍然很有价值的数据。如果样品量充足，但不可能或很难再次收集，我们会建议使用数据产量最高的技术，大部分情况下是高通量测序，结合不同的操作步骤不仅能捕获基因表达数据，还有小RNA和长链非编码RNA序列。另一方面，如果成本和周转时间是最重要的考虑因素，那么实时定量PCR仍是一个很有价值的选择，可以较低通量轻松鉴定基因表达，并验证测序和芯片实验的数据。