在各种微生物中分布广泛，特别在细菌中更为广泛。由蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 5/B与B. cereus 569分别得到分子量为35200与31500的青霉素酶结晶，从巨大芽孢杆菌B. megaterium 提取出α，β，γ青霉素酶结晶，随后从不同细菌又分离出多种青霉素酶。青霉素酶对热极不稳定，分解β-内酰胺的速度因青霉素与酶的种类不同而异，但对6-氨基青霉烷酸（6-APA）作用却很微弱。酶反应最适PH值为6.0～6.5. 以青霉素G钾盐为底物，Km为4.32×10-3M(5/B酶)；
4.89×10-3M(569酶)。细菌产生青霉素酶导致出现耐药性，临床上已分离出多种类型青霉素酶，白色粉末。分子量50000。溶于水。酶溶液易失活，冻干品2～8℃可稳定一周。青霉素酶作用于青霉素的β-内酰胺环，使青霉素转变为无抗菌活性的青霉素酮酸（penicilloic acid）。医疗上用于青霉素过敏症状的治疗。青霉素酶在实验中用于破坏或抑制青霉素活性。