纳米颗粒与外泌体电镜图像的对比分析

各位外泌体领域的朋友们，你们是不是打到过这样的电镜图？ 

如果打到过，那就来读一下这个文章吧。让我们一起学习一下如何识别电镜下的外泌体。

外泌体是这几年开始兴起的一个朝阳领域，它是细胞分泌的一种直径在30-100nm（另一种说法是 30-150nm）的膜泡结构，可以介导细胞间物质的交换和信息通讯。相信大家对这些早已耳熟能详，笔者在此不多做赘述。外泌体的分离是困扰刚刚进入该领域研究者的主要问题，从分离角度讲目前大家分离外泌体主要通过一下集中手段：差速超速离心法、梯度密度离心法、沉淀试剂盒、凝胶排阻分离法、膜亲和试剂盒等手段，后两者主要用于同时分离所有的胞外囊泡组分。以上诸多分离方法中，梯度密度离心的分离方法是公认可以得到最高纯度的分离方法，但是操作相对复杂，目前使用并不广泛。以目前的手段来说，我们很难拿到纯的外泌体组分，而多是以外泌体为主要组分的胞外微囊泡，笔者在这里对两者不做过多区分。关于分离的一些经验技巧，朋友们可以参考 “外泌体之家” 分离鉴定板块的相关贴子，笔者适时在以后的文章中会详细展开。

外泌体的鉴定是既分离后又一个困扰研究者的问题，一般研究者需要通过透射电镜观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形），通过粒子直径分析系统测算和统计样品中粒子的直径分布，通过western blot检测样品中是否有外泌体相关marker蛋白的富集。另外，当电镜图观测到的样品结构不是典型外泌体样结构时，还需要增加免疫胶体金电镜进行验证。本文笔者将通过纳米颗粒与外泌体电镜图像的对比来总结外泌体电镜图的鉴别方法，争取让大家明白为什么外泌体电镜需要看到具有膜结构的茶托样纳米粒子才能算是看到了外泌体。

让我们先来看一张经典的外泌体电镜图：

Théry, Clotilde, et al. "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Current protocols in cell biology(2006): 3-22.

这是外泌体领域的大牛Thery在2006年发表的外泌体分离鉴定手册上的图样。可以看到，电镜视野中大多是略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构，小图中显示免疫胶体金会附着到这些膜结构表面。同时thery提供了详尽的电镜制样protocol。当然通常来说我们在论文里秀图的时候不需要制作如此精美的电镜图，通常我们只需要做一个负染电镜，并且可以外泌体结构即可。下图是“外泌体之家” 电镜板块一些朋友秀出的比较典型的样图。

Dqq图    hzangs图

一般来说，paper里电镜验证样品中分离得到的是外泌体，有上面这两张图的质量即可。可以看到，这两张图具有明显的膜，立体结构清晰，同时具有茶托样或凹半球样结构。

看完这些图，基本上大家对外泌体的电镜图样有了清晰的认识。下面，让我们开始做一些对比，来看一下大家电镜图中打到的其他结构可能是什么。笔者对其他领域的东西了解不多，可能在图注上可能与原文有些许出入，还希望懂的朋友多多指正。

Veterinary Diagnostic using Transmission Electron Microscopy大家猜猜这是什么？ bar：70nm  这个其实是腺病毒。

DARL M, Harrison P M, Bottke W. Expression in Escherichia coli of a secreted invertebrate ferritin[J]. European Journal of Biochemistry, 1994, 222(2): 367-376.
看这个，bar：50nm，看上去圆圆的是不是很像外泌体呢？ 其实这个是铁蛋白结晶。

Veterinary Diagnostic using Transmission Electron Microscopy
这个看上去很像茶托，出了没有明显的立体结构，基本剩下的特点都和外泌体相符。其实，这个是疱疹病毒的电镜图。

Douglas T, Young M. Host–guest encapsulation of materials by assembled virus protein cages[J]. Nature, 1998, 393(6681): 152-155.
这个电镜图中b图像极了外泌体，但是其实他们还是病毒，最大的区别就在于，这个粒子的直径相比外泌体而言小了。有些试剂盒秀的电镜图类似这个。

Park C W, Yang H M, Lee H J, et al. Core–shell nanogel of PEG–poly (aspartic acid) and its pH-responsive release of rh-insulin[J]. Soft Matter, 2013, 9(6): 1781-1788.
很多使用沉淀试剂盒的朋友拿到了这样的电镜图，甚至有些kit的官方网站挂出的电镜图都是这个样子的，更有一些paper里的电镜结果都是这个样子的……但是呢，其实这个是PEG和一些蛋白的聚沉物。
看完这么多乱七八糟的电镜图是不是有点晕了呢，让我们在看几张CNS paper里的电镜图，回顾一下真正的外泌体长成什么样子吧。
Fong M Y, Zhou W, Liu L, et al. Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis[J]. Nature cell biology, 2015, 17(2): 183-194.

Melo S A, Luecke L B, Kahlert C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015.

        综合起来说呢，电镜结果是需要有一定的经验才能识别出是不是外泌体的。要记住，外泌体在电镜下面应该是具有非常明显膜结构的30-100nm （其实电镜下会有很多200nm一下的外泌体）大小不一的茶托样结构，而其他形状的结构都可能是存在问题的。 有些理论认为，不同的电镜图是由于电镜的型号造成的，其实笔者看来并不是这样，电镜结果的好坏很大程度上是由于样品分离方法、样品性质造成的，换句话说，我们拿着PEG聚沉物是永远打不出经典的外泌体电镜图的，只有真正的通过PEG聚沉得到了外泌体才有可能看到外泌体的结构。

目前市面上包括 SBI在内的沉淀kit 可能都有这样的结果，它们的沉淀量和粒子数目明显高于超速离心的产量，但是电镜图却远没有超速离心得到的样品那么好，甚至一些kit官网的电镜图中都可以看到PEG聚沉物甚至看到一些病毒、支原体的“影子”。电镜图上的一些信息，可能可以解释为什么沉淀试剂盒会有那么惊人的产量了。 当然，大家也不必纠结，其实对照组设置好了，实验结果还是相对可信的。对于一些IF不算太高的杂志，对电镜图的要求还是比较低的，kit拿到的结果还是可以接受的。但是如果你是瞄准着10分以上的刊物在做课题的话，笔者建议你拿到了电镜下有经典外泌体结构的样品后再继续试验吧。