纳米孔测序技术用于快速的病毒病原体的鉴定及进化研究

　　2014-2016年，西非暴发埃博拉疫情流行期间，进行了大量ELISA和基于RT-PCR的检测，这些方法的检测虽然简易、便携、快速，但由于病原体不断进化，这些方法很快变得过时，并且还缺乏能在症状出现前检测出病毒的方法。

　　使用传统的测序技术虽然可以克服病原体不断进化的问题，但这一技术只有在将样品送至设有相关基础设施的检测点后才能实现。并且，这样做还将进一步延长从采样到获得结果的时间，增加了管理负担和管理复杂性，导致此类项目滋生诸多实际问题。

　　相比之下，实时、便携的纳米孔测序技术可大大提高病毒分析速度，据报告从采样到获得结果的时间不到6小时。图1为埃博拉病毒不同检测方法之间的比较。

图1 埃博拉病毒的不同检测方法与各自从采样到获得结果的相应时间表。该表根据早先发表的数据绘制。

研究案例一：RNA病毒基因组的快速测序

　　cDNA测序提供的灵敏度和PCR法相当，而直接RNA测序提供了最快的样本到结果周转时间——没有扩增或逆转录偏差。

　　肠道病毒 (EV）是一种单链RNA病毒，每年可造成全球数百万人感染。感染引起的临床表现范围很广，可从良性咽喉痛到更为严重的情况，如支气管炎和肺炎。

　　基于PCR的检测是常规鉴定具有临床价值的病毒最常用的方法，然而，病毒基因组中经常出现的点突变和重组事件有可能导致出现假阴性结果，且病毒培养通常需要5-10天——这大大延迟了拿到结果的时间。

　　瑞士伯尔尼大学的Alban Ramette博士及其小组用RNA直接测序的样本制备方法，只用5.5个小时，快速鉴定出柯萨奇病毒病原体，而cDNA方法需要23个小时。为了进一步简化该过程，研究人员从粪便样品获取了RNA直接测序的样本，并且没有预先行病毒培养。尽管样本制备方法仅产生了140ng的RNA——与推荐的500ng起始量相差远——但该小组根据11个读长 (其长度通常大于1000个碱基）测序并组装出了完整的柯萨奇病毒(Coxsackievirus）基因组。此外，研究显示，一条含有7208个碱基的单一读长几乎覆盖了整个基因组（与参照柯萨奇病毒基因组序列相比，仅在序列的5’和3’末端少了25和109个碱基)。

图 2使用纳米孔技术对从培养的柯萨奇病毒(Coxsackievirus）分离株中获得的cDNA进行测序，在测序的几分钟内便达到了98.8％的序列一致性准确度，并且该一致性准确度值在长达16小时的进一步测序中未呈明显提高。使用nanopolish工具处理在测序10分钟内获得的首批5-10,000读长，能将该准确度提高到99.8％。图片由瑞士伯尔尼大学的Alban Ramette博士提供。

研究案例二：了解大型DNA病毒的进化

　　证明了长读长测序能够对复杂的基因组动力学进行高分辨率的分析。这种类型的分析为明确确定串联基因重复的序列内容，并准确识别这些基因重复内的变体提供了框架。

　　与其他双链DNA（dsDNA）病毒一样，牛痘病毒具有快速适应的能力，尽管其单核苷酸突变率相对较低（与单链DNA或RNA病毒相比)。之前对病毒的研究鉴定了出两种会抑制宿主应对感染反应的蛋白质——E3L和K3L。根据犹他大学的研究小组的研究，短读长测序平台能提供在群体水平上了解H47R等位基因频率以及K3L基因座上总体覆盖度变化的信息；然而，它们不能在串联重复序列中进行点突变的基因分型或鉴定拷贝数的变化。

　　为了了解病毒进化过程中产生的这些独特的适应机制，美国犹他大学的研究小组转向了由纳米孔技术提供的、能够跨越大型重复DNA区域的长序列读长。结果显示，尽管拷贝数的增加稳定在第10代（高达15拷贝)，H47R 的SNP累积则是由第10代的低频率累积到第20代的近乎固定不变（图3)。该研究小组还表明，两种遗传改变的组合对病毒适应性的增加要比单独基因的改变增加得更多。该小组利用纳米孔技术提出了一种dsDNA病毒进化的新方式，其中罕见的有利变体迅速固定在多个基因拷贝中。

图 3 对于H47R等位基因，含有多个K3L基因拷贝的基因组迅速同源化，这意味着突变使得适应性增加。图片由美国犹他大学的Thomas Sasani提供。

研究案例三：病毒病原体鉴定

　　使用纳米孔测序6小时内完成宏基因组病毒鉴定。

　　宏基因组病原体的即时检测技术将成为传染病治疗领域一项极具价值的检测手段。Greninger等人证实，纳米孔技术可很好解决这一需求。

　　研究者对2014年暴发于刚果的埃博拉出血热病疫情的2份血样进行了检测，一份为2014年爆发于波多黎各的疫情中的基孔肯雅病 (CHIKV) 阳性血浆样本，另一份为丙型肝炎 (HCV) 阳性血清样本。血样中病毒滴度的范围为105-108拷贝/ml，仅利用纳米孔读长，对近乎完整 (90%) 的CHIKV病毒基因组完成了测序，其准确度极高，同源性达97-99%。各样本的首个病原体读长的检测均在40分钟的测序窗口期内完成 (图4)。

图4 临床样本中首个CHIKV读长在6分钟内完成测序，进入测序运行。图片由美国加州大学旧金山医学院Charles Chiu教授提供；选自发表于生物医学中心的一篇文章中的图片。