浅析紫外分光光度计测定蛋白质含量原理

紫外分光光度计测定蛋白质含量原理是为了学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。掌握TU-1901紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
    紫外可见分光光度计实验原理是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外光：10-400 nm，可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉)，特点：带光谱、分子光谱。

    实验步骤

一，启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比(参比溶液不可取出)。在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数(起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描)。将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。
   
二，吸收曲线的制作:(找出最大吸收波长)；将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。
   
三，标准曲线的制作；在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件(测量波长：278.00 nm)。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：
   
四，样品测定；配制三份待测蛋白质溶液，(取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度)按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL ?10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。
   
五，注意事项；准备工作：在测量前应把机器预热半小时。溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH值的改变而改变，故进行样品测定时的PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。测量工作：吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。