如何在猕猴桃成熟期间提高乙烯产生及其中间体含量

　　2021年6月16日，New Phytologist在线发表了浙江大学农业与生物技术学院殷学仁教授课题组题为“An ethylene-hypersensitive methionine sulfoxide reductase regulated by NAC transcription factors increases methionine pool size and ethylene production during kiwifruit ripening”的研究论文。该研究发现由NAC转录因子AdNAC2和AdNAC72所调控的乙烯响应性甲硫氨酸亚砜还原酶编码基因AdMsrB1，可在猕猴桃成熟期间提高乙烯产生及其生物合成中间体的含量。

　　研究背景

　　乙烯通过触发成熟相关基因表达的动态变化，在调节果实成熟中发挥重要作用。在番茄中已有大量的乙烯合成和信号转导途径相关基因的功能被发现和鉴定。尽管番茄和多年生水果作物之间有许多相似之处，但最近研究表明，不同水果在乙烯信号或响应的调控方面存在明显差异。另外，在这些非模式水果作物中还有一些与成熟相关但功能未知的基因。猕猴桃（Actinidia spp.）是一种多年生跃变型水果作物，在成熟过程中产生大量的乙烯，也是乙烯敏感型水果之一。此外，在猕猴桃成熟过程中，果实软化与内源性跃变乙烯产生速率的上升之间存在明显分离。因此，猕猴桃是研究果实成熟期间乙烯产生和信号转导的理想选择。

　　主要结果

　　1.乙烯过敏性基因AdMsrB1的鉴定

　　为鉴定猕猴桃中的早期乙烯响应基因，对前期经乙烯处理和非处理水果的转录组数据进行分析发现，甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductase）编码基因AdMsrB1对乙烯表现出超敏反应，其表达水平显著高于其他响应基因。底物特异性分析显示，AdMsrB1不存在时，甲硫氨酸亚砜（MetSO）被分成Met-S-SO和Met-R-SO两种不同的立体异构体，且R型丰度高于S型。当加入AdMsrB1蛋白时，Met-R-SO显著减少，伴随Met峰值相应增加，表明MetSO的R对映体是AdMsrB1的首选底物，并被转换为Met。

　　2.AdMsrB1的稳定过表达增加了猕猴桃叶片中游离Met和ACC的含量

　　为研究AdMsrB1在植物体内的功能，首先获得了AdMsrB1稳定过表达的东红猕猴桃株系。乙烯处理分析发现，AdMsrB1过表达株系叶片中游离Met的含量显著高于对照植株叶片，乙烯生物合成的直接前体ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）也显著增加，乙烯释放量随之提高（图1）。

　　图1. AdMsrB1过表达猕猴桃植株的表型鉴定

　　3.乙烯促进AdMsrB1和响应性转录因子AdNAC2和AdNAC72转录本的积累

　　AdMsrB1启动子对乙烯响应的活性检测结果表明，乙烯处理后AdMsrB1表达水平的增加并不是源于乙烯或乙烯相关转录因子对AdMsrB1启动子的直接调控。进一步通过RNA-seq分析以及双荧光素酶活性检测发现，AdMsrB1启动子活性受乙烯响应性转录因子AdNAC2和AdNAC72的显著诱导。EMSA实验结果显示，AdNAC2和AdNAC72与AdMsrB1启动子直接结合。

　　4.AdNAC72的过表达激活了AdMsrB1表达，并增加了游离Met和ACC含量

　　已知AdNAC2与番茄成熟相关转录因子NOR（NON-RIPENING）同源。为深入解析NAC转录因子的调控作用，同样首先获得了AdNAC72稳定过表达猕猴桃株系。乙烯处理后检测发现，AdNAC72过表达株系的AdMsrB1转录水平显著升高，叶片中游离Met和AAC含量较对照显著增加，内源性乙烯的产生也明显提高（图2）。此外，猕猴桃愈伤组织中AdNAC2的过表达也显示AdMsrB1转录丰度的增加。

　　图2. AdNAC72过表达猕猴桃植株的表型分析

　　一图解文

　　乙烯处理触发AdNAC2和AdNAC72的表达，它们作为转录激活因子通过直接结合AdMsrB1启动子来上调该基因的表达。AdMsrB1特异性作用于氧化应激诱导产生的甲硫氨酸亚砜（MetSO）的R对映体，将其还原为甲硫氨酸（Met），以增加游离Met和乙烯前体ACC的含量，从而促使乙烯合成的增加和释放，进而促进果实成熟。

　　图3.AdMsrB1、AdNAC2和AdNAC72在猕猴桃成熟期间的工作模型