三分钟了解4代基因测序技术

　　基因检测技术是近年来伴随“精准医疗”概念的提出而迅速发展起来的一门科学技术，它可以从基因组机制上阐释遗传学、发育生物学、进化生物学等学科的经典概念，在全基因组水平延伸了染色体高级构象、细胞异质性、功能模块等新概念，为精准医学开辟了应用性新领域。

　　近年来，随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，基因检测成为临床诊断和研究的热点。基因检测技术应用于遗传病诊断、罕见病、产前筛查、临床个体用药以及肿瘤监诊断疗等领城的科研成果也层出不穷。

　　目前，应用较广的基因检测技术大致分三类：基因测序、以核酸扩增为基础的PCR技术，以荧光杂交检测为基础的FISH技术。这三类技术沟通构成了基因检测基础，大部分基因检测项目都有赖于这三项基础技术开展。与PCR和FISH技术相比，基因测序技术可直接读取DNA分子的30亿个碱基序列，具有高通量、数据量大的特点。此外，基因芯片技术应用范围也较广。

基因检测技术对比

　　在本文中，小编汇总了4代基因测序技术并比较其优缺点，以期帮助正在从事基因检测工作或行业的您，了解这项技术的发展历程。

基因组学与基因检测技术的概述

　　基因组学是伴随“人类基因组计划”发展起来的一门新兴学科，是新世纪科学的莫基学科，已成为生命科学发展的基础性和引领性学科。20世纪50年代， Watson和 Crick提出DNA双螺旋结构后，人们对基因的遺传学功能逐渐有所认识，并开始致力于DNA序列检测的探索。1975年 Sanger等发明了第一代测序技术并在1980年完成了人类历史上第一个基因组序列¬——噬菌体X174的测序，它标志着人类正是进入基因组学时代。从1985年人类基因组计划提出，到2001年人类基因组草图完成，基因组学的研究也从以全基因组测序转向以基因功能鉴定为日标的后基因组时代。

　　基因检测技术经过近70年的发，从第一代的双脱氧链测序技术已经发展到第四代固态纳米测序技术。测序技术的发展使人们能够方便准确地获取大量的基因组信息，并将其应用于疾病的研究，借此人们遜渐认识到基因变异与疾病发生发晨的关系。同时，基因检测技术也越来越多地被应用于疾病的临床诊断和治疗。

　　第一代测序技术

　　早在1954年， Whitfeld就已经报道使用层析法测定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代测序技术的标志是 Sanger于1977年发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法，以及 Maxam和 Gilbert于同年发明的DNA化学降解测序法。其中， Sanger法的核心原理是:由于dNTP的2'和3'都不含羟基，在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分別加入一定比例带有放射性同位素标记的 ddNTP(分别为: ddATP、dCTP、dGTP和drP)，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

Sanger测序工作流程

　　Sanger测序技术操作快速、简单，因此被广泛应用。20世纪80年代末，荧光标记技术凭借着更加安全简便的特性，逐步取代同位素标记技术，由此也诞生了自动化测序技术。由于可以用不同荧光标记4种dNTP，使得最后产物的电泳分离过程可以在一个泳道内实现，用激光对 ddNTP上的荧光标记进行激发，然后检测不同波长的信号，通过计算机处理信号后可获得碱基序列，很好地解决了原技术中不同泳道迁移率存在差异的问题。自动化仪测序大大提高了测序效率，如ABI3730和 Amersham MEGABACE测序仪分别可以在一次运行中分析96个或384个样本。第代测序仪在人类基因组计划DNA测序的后期阶段起到了关键的作用，使人类基因组计划比原计划提前两年完成。

　　双脱氧链末端终止法的优点:

　　（1）可用于未知或已知突变的检测，更容易实行；

　　（2）假条带的出现减少，结果更加清楚；

　　（3）读取的长度也较长；

　　（4）因为掺入了同位素标记的三磷酸，末端终止法可以测更小序列的核苷酸链；

　　（5）基本适用于所有的突变类型，准确率几乎100%，在单基因病的基因诊断和产前诊断中仍广泛。

　　使用双脱氧末端终止法的缺点：

　　（1）离不开PCR扩增，且只能分析单个的DNA片段，通量小，不能进行基因组层面的分析；

　　（2）自动化程度低，检测速度慢，对于某些需要快速检测的疾病不适合；

　　（3）双脱氧链末终止法成本高，不适用于大规模测序。

　　第二代测序技术（NGS）

　　当前最具代表性的第二代测序平台包括:瑞土罗氏公司( Roche)的454测序仪、美国 Illumina公司的Solexa基因组测序仪、美国ABI公司的 SOLID测序仪等。第二代测序技术的原理是边合成边测序，即依照第一代 Sanger测序技术的原理，通过测序仪器捕捉新掺人的末端荧光标记来确定DNA序列组成。鉴于Illumina的NGS技术已经成为市场主流，因此接下来将详细介绍Illumina的Solexa测序技术的。

Solexa测序工作流程

　　Solexa测序核心技术是DNA簇和可逆终止化学反应。测序前先将模板样品DNA片段打碎形成100~200bp的片段，然后在这些片段两端加上特定的测序接头。而 Solexa高通量测序芯片表面附着一层单链引物，两端连有接头的单链DNA片段通过与芯片表面的引物碱基互补结合，经PCR扩增成为双链。至此DNA的一端就被锚定在测序芯片上，而另一端则随机和附近的引物互补结合，从而也被固定住，形成“桥式结构。这样经过反复30轮扩增循环后，每个DNA片段得到约1000倍扩増，形成单克隆DNA簇。然后掺入经过改造的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的DNTP。这些dNTP就是“可逆终止子”，其3'羟基端带有可化学切割的部分，每个循环只允许掺入1个碱基用激光扫描测序芯片表面，读取聚合上去的相关核苷酸种类。随后将这些核苷酸化学切割，恢复3'端黏性。继续聚合核苷酸。如此循环，直至每条模板序列都被聚合成双链。此过程中带有荧光标记的dTP能够释放出相应的荧光，测序仪据此捕捉荧光信号，之后计算机可以将荧光信号转化为不同颜色的测序峰图，便可得知测序样品的DNA序列

　　较第一代测序技术而言，第二代测序技术的测量通量显著提高，是目前市场上主流的测序技术。但边合成边测序的原理也为其带来相应不足之处，测序读长较短和需要模板扩増是两个主要的弊端所在。第二代测序的读长一般在700bp左右，为后续的序列拼接、组装及注释等生物信息学分析带来了较大困难；由于PCR反应的灵敏性，导致扩增前后得到的DNA分子片段的数目有较大偏差，因此在分析基因表达方面存在较大的弊端。在此基础上，无需扩増、读长更长的第三代测序技术便应运而生。

　　NGS的优势:

　　（1）高通量，高淮确性，高灵敏度；

　　（2）自动化程度高；

　　（3）成本低；

　　（4）可用于未知物种，未知基因的检测。

　　第三代测序技术（单分子DNA测序）

　　第三代测序技术基于单分子读取技术，不需要PCR扩增，具有巨大的应用前景。现有的第三代测序平台包括美国 Helicos Bioscience公司的 Heliscope遗传分析系统和 Paciffic Biosciences公司的单分子实时测序系统(SMRT)。两者均继承了第二代测序技术的边合成边测序的原理，其中SMRT系统是基于零级波导( zero mode waveguide， ZMW)的测序技术。ZMW是种直径50~100m、深约100mm的孔状纳米光电结构，当光线进人后呈指数衰减，仅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色荧光标记的dTP后进行DNA合成，只有参加反应的dNTP才能停留在ZMW底部，从而使dNTP的荧光信号被识别。

　　第三代测序技术是计算机学、生物学、化学等多个学科领域研究相结合的结晶，功能非常强大。其显著特点是单分子测序，即不经PCR，可直接进行边合成边测序。这不仅简化了样品处理过程，避免了扩增可能引入的错配，而且不受A、T、G、C这4种碱基含量的影响，因此第三代测序技术能直接对RNA和甲基化DNA序列进行测序。

　　SMRT优点：

　　（1）超长读取；

　　（2）无需模板扩增；

　　（3）运行时间短，读取速度可达每秒10个碱基；

　　（4）能够直接检测表观修饰位点。

　　第四代测测序技术（纳米孔测序）

　　目前，第二、三代测序技术均是基于光信号的测序技术，都需要昂贵的光学监测系统，并依赖DNA聚合酶读取碱基序列，大大地増加了测序的成本。因此开发不使用生物化学试剂，直接读取DNA序列信息的新型测序方法，就成为第四代测序技术的主要思想。其中的代表当属纳米孔测序，如英国 Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米孔测序，是基于电信号的测序技术。它利用镶嵌于脂质双分子层中的经过基因工程改造过的-溶血素蛋白作为纳米孔道，孔内共价结合有分子接头。由于A、T、G、C这4种碱基存在电荷差异，当DNA碱基通过纳米孔时，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(4种碱基所影响的电流变化幅度各不相同)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势。但是目前还处在起步阶段，在关键环节(如纳米孔的制造和DNA分子通过纳米孔的速度控制方面)还有待改善。

展望

　　纵观基因组测序技术的发展历程可以看出，从第一代到第四代测序技术无一例外地均以提高测序通量与读长、降低测序成本、简化测序步骤为目标。尽管目前最为先进的纳米测序技术具有诸多进步，但仍面临很多挑战。我们有理由相信，当前新一代测序技术面临的难点会逐渐攻破，基因测序指导下的遺传病诊治、精准医疗等能够更加高效的进行。