staurosporine诱导的细胞凋亡

妊娠的C57BL 6cr小鼠

staurosporine 蒸馏水 脱氢酶 ZVAD-fmk LDH试剂盒 Caspase3试剂盒 胶原酶Ⅱ 醌 氯化钡 细胞计数试剂盒 STS TrypsinEDTA DIDS NPPB

显微镜 试管 离心管 移液枪 离心管盒 冰盒 冰箱 培养箱 离心机 载玻片 盖玻片

一、原代心肌细胞的培养及实验方案

1. 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心脏，按改良的Lader方法进行细胞的分离。 获取博动的心脏迅速放置于无Ca²⁺、Mg²⁺的Hank’s平衡液中。

2. 剪碎心脏，放置在4℃条件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h，用Trypsin抑制剂中止消化。

3. 然后在37℃下，用胶原酶Ⅱ于CO2培养箱内，在摇床上继续孵化消化45~60 min。

4. 最后用70 μm直径尼龙过滤网过滤获取心肌细胞，用含有25 mmol/LHCO3^-，100 mL/L FSB，1×10⁵ u/L青霉素G和50 g/L链霉素的M199培养基制成细胞悬液，按差速贴壁分离法纯化心肌细胞。

5. 加入10 μmol/L BrdU到细胞悬液，以6×10⁵密度种植于96或24孔细胞培养板上，置37℃培养箱培养。

6. 培养的心肌细胞24 h后更换含有10 μmol/L BrdU新鲜M199培养基，培养72 h后进行实验使用。

7. 设立阴性、阳性对照及实验组，每组20孔；阳性对照加入4 μmol/L STS，实验组中加入4 μmol/L STS后再分别加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更换新鲜M199培养基继续孵化4 h后进行各种指标的检测。

二、细胞存活试验

1. 按照实验方案处理后的培养心肌细胞，每100 μL培养基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h，用分光比色仪进行检测，实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=A试验组/A对照组×100%。MTT法A值既能反映心肌细胞内线粒体脱氢酶活性，又能间接反映心肌细胞的增殖与存活情况。

三、凋亡琼脂糖凝胶电泳检测

1. 收集24孔板处理过的细胞，弃上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase细胞裂解液(10 μmol/L Tris·HCl，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS)，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K继续孵化。

2. 1 h后加入等体积的酚、氯仿、异丙醇（25∶24∶1）充分摇匀，离心取上清再加入等体积的氯仿抽提1次，转移的上清液中再加1/10体积3 mol/L醋酸钠及两倍体积的无水乙醇过夜后离心，700 mL/L的乙醇洗涤后，TE液溶解DNA，于20 g/L含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下观察、记录拍照。

三、Caspase3活性的检测

使用ApoONETM Homogeneous Caspase3试剂盒检测Caspase3活性。实验设立空白、阴性对照及实验组，含有100 μL培养基的实验细胞中，加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和缓冲液，在室温下轻微摇动孵化6~8 h，用荧光检测仪于激发波为485 nm，散发波长538 nm处，读取检测荧光值.

四、心肌细胞膜完整性检测

细胞培养上清乳酸脱氢酶（LDH）活性检测，LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。取细胞培养上清50 μL，反应后490 nm处测A值。

1. 严格进行消毒．使用三套器械取材。

2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。

4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。