发布时间:2019-02-20 10:36 原文链接: NBT特别关注丨6位大咖指引心肌干细胞领域“再生”

  2018年,Anversa实验室超过30篇文章由于造假而撤稿,这一事件对于心肌细胞治疗领域带来了非常负面的影响。在过去的18年间,许多医生和科学家以此不实结论花费数年进行的科学研究变得毫无意义,不仅使病人蒙受了极大的损失,在该领域里投入的数百万计资金也付之东流。然而,骨髓细胞或者是成体驻留的心肌祖细胞能够转分化为心肌细胞这一前提却远远没有被证明。论文作者对于此领域进行了回顾性分析,对问题出现的过程进行了详细梳理,同时整合了现有领域的内容,正是为了警惕以后在论文编辑、同行评议、基金资助、学术单位中出现此类对于疑问视而不见的情况。同时,论文作者也建议以科学态度为驱动,以新的科研方法去面对心肌细胞再生方面遇到的难题。

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  再生医学的终极目标是在生命受到损伤或者是疾病情况下修复损伤的器官和组织。但是对于心脏来说,心肌细胞治疗领域急需“再生”——该领域由于超过三十篇关于成体血细胞或者是心脏内源干细胞能够修复心肌损伤的不实报道而被严重损害。由于末期心脏衰竭对于心肌细胞再生的需求,加之心脏移植捐献者数量极为有限,Anversa和他的同事们从2001年至今,似乎为病人、医生和科学家带来了曙光。在那时,除了造血干细胞治疗之外,心肌细胞再生可能是干细胞基础科学研究转化为临床实践方面最闪亮的实例。然而,经过数十项临床研究和(或)试验以及近20年基本上毫无成果的工作,使得公众对这一领域的信心明显下降,全世界数百万终末期心脏病患者的希望也随之破灭。在这个心血管再生医学领域的关键时刻,对这一生物医学悲剧的发生进行清晰、坦率的回顾性分析是非常及时且有必要的。此文章的唯一目的是帮助避免在任何再生医学领域的重复类似的错误,并为心肌细胞治疗制定一个纠错方案。

  想法的扎根

  造血干细胞可以向大多数或所有非血液组织进行转分化的观点是如何站住脚跟的?这一观点根植于20世纪90年代末——干细胞领域的一个非常高产的时期。克隆羊多利的顺利出生,证明了成体细胞具有被重编程为全能性干细胞的可能性。随后,1998年人体胚胎干细胞也被成功分离。然而在当时还有另一种假说:即认为成体干细胞具有高度可塑性,当移植到新环境中时,可以“转分化”成该位置的细胞。在千禧年,有一些报道对于造血干细胞转分化成为脑、肺、肝脏等提出了假说。尽管这些假说并没有被证明,然而这些假说带来了“没有什么不可能”的思潮。

  深入研究,很明显当时这些打破常规的研究与造血和移植学几十年的工作背道而驰。造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)被分离出来后,被证明可以自我更新以及分化为生命所需要的所有血细胞类型。于是20世纪90年代,造血干细胞移植替代骨髓、动员后外周血或脐带血移植在实验室以及自体移植临床试验中进行了尝试并获得了成功。然而,造血干细胞可否分化为非血细胞?2002年的一项研究表明并没有观察到循环的造血干细胞向非造血细胞转化。2005年,一项追踪移植到小鼠体内的造血干细胞的研究也没有发现造血干细胞能够转分化成血细胞类型以外的细胞。戏剧性的是,随后发表的几篇论文却反驳了这些数据,声称造血干细胞可以转分化为其它类型的细胞。

  这些研究的发表,表明许多个人及组织并没有采纳干细胞生物学领域相关专家的建议。其中包括声称造血干细胞具有可塑性的研究人员,他们认为这些细胞在注入动物体内后可以转化为其他组织的细胞;也有一些高水平的杂志推波助澜,尽管许多干细胞领域的专家都发表了负面的意见,但是他们仍然接收了一些声称造血干细胞或者血液细胞能够转分化形成心脏、脑、肠以及骨骼肌的研究论文。有一些期刊拒绝关于首次分离人类胚胎脑干细胞的文章(这种再生能力严格局限于他们获取的组织),但是却发表另外的声称脑干细胞可以造血的论文(发表在Science杂志)。同时,应当受到谴责的也包括那些将大把资金用于声称能够用非常简单的策略比如将骨骼肌细胞转入受伤的组织然后看会发生什么的基金组织。

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基础研究发现或临床前研究支持或者反对心肌干细胞治疗的时间轴。

  不堪的历史

  基于几个世纪的临床和实验观察,长期以来,病理学家一直认为心脏是人体中再生能力最差的器官之一。然而,在90年代后期,Anversa研究组向这些学说提出挑战,认为心脏是具有自我再生能力的器官。从2001年开始,他们发表了一系列文章声称人类心脏中含有高水平的处于有丝分裂期的心肌细胞,这些处在细胞周期中的细胞能够变成心肌细胞,并且骨髓细胞能够被血液形成因子诱导促进小鼠中的心脏再生。同年,Anversa研究组发表了一篇极具争论的文章,他们表明受损的心脏能够明显地被表达c-kit的骨髓干细胞移植再生。尽管该结论只是基于单只小鼠的研究,该方法还是被快速的转化为临床试验并于次年发表。这些原始的、简单的、基于小鼠的工作,再加上当地的评审委员会对于临床试验管理方面的宽松处理,导致这项研究几乎在没有障碍的情况下进入了临床试验。这些试验声称可以快速干预急性心肌梗死,因此该工作迅速被广泛传播和进入大规模临床研究,其中的某些研究甚至还发表在一些主流医学杂志上。

  值得庆幸的是,同期有些研究者表明不能重复Anversa研究组最初的发现。2004年发表的三篇文章提供了直接的、明确的证据表示移植的骨髓细胞不能转分化形成心肌细胞。但是,这些研究的基础并不明确,因为这些发现完全依赖于骨髓细胞谱系的标记物与心肌细胞标记物的免疫荧光染色。众所周知,免疫染色是一个比遗传重组更加主观和缺乏严格标准的检测方式,同时在染心肌细胞时很难去除高度非特异性背景的干扰。为了克服这一困难,利用可追踪的、特异性敲除的Cre-loxp重组酶系统鉴定心脏中的肌肉和非肌肉组分的心脏祖细胞,逐渐变成心脏干细胞和祖细胞身份鉴定的金标准。值得注意的是,可发育为大部分心肌细胞的胚胎心肌祖细胞在成体心脏中并不存在。

  尽管这些发现都反驳了Anversa的结论并且将该科学争论进一步升级,相关的临床试验并没有放慢。而大量不可控的临床试验也只报道得到了一点有益的信号。这些结果后来被归因于未知的“旁分泌信号”,而不是由于直接产生新的心肌细胞。正如下文所述,旁分泌可能通过增强血管形成、减少纤维化和促进心肌梗死后宿主心肌细胞的存活来提高心脏功能。

  焦点的转移

  当临床团体还在继续研究骨髓细胞转分化的可能,Anversa小组却将目光从骨髓细胞转分化转移到了心脏干细胞,他们认为心脏本身包含一个同样表达c-kit的干细胞群体。有趣的是,该实验结论同样是基于免疫染色和移植实验,并没有任何通过Cre重组酶细胞谱系追踪等证据表明成人心脏c-kit+细胞是先天“干细胞”。在他们的研究中,他们认为这些成体的“心脏干细胞”,或简称CSCs,是取之不尽、用之不竭的,它们负责啮齿动物以及人类正常、大规模的心肌细胞循环。此外,他们还声称,CSCs很容易识别和分离和便于移植。这些大胆且具有潜在重要意义的研究引发了大量实验室与Anversa进行合作。同样,这些研究报也声称,心脏中c-kit+细胞是可以使心脏再生的,只是结果并不那么显著。同时,其他组也分离出更多的"CSCs"。也有一些研究在c-kit的基础上加入了其它的造血细胞表面标记,如Sca-1;而另一些研究则证明CSCs可以生长为三维的心脏小球(cardiospheres)。

  基于此,几个小组进行了CSCs的临床试验。例如, Bolli研究组与Anversa研究组一起将心脏c-kit+细胞运送到慢性缺血性心力衰竭患者的心脏。他们报告说,与对照组相比,治疗组的安全性良好,心脏功能明显改善。正如下文所讨论的,这些发现的真实性现在受到质疑。Marbán研究组在最近的心肌梗死患者中测试了心脏小球干细胞(cardiospheres)。他们报告说,这些细胞是安全的,但对整体心脏功能没有好处。目前,这些临床研究组仍在继续。

  最近,美国国立卫生研究院(NIH)发起了一项名为CONCERT-HF (NCT02501811)的临床试验,拟对慢性缺血性心力衰竭患者分别移植心脏c-kit+细胞、骨髓间充质细胞、两者的混合,并进行比较。截至撰写本文时,患者登记工作已基本完成,其中一名患者死于分离c-kit+细胞时进行的心脏活检引起的出血并发症。

  大厦的崩溃

  在接下来的几年里,许多研究小组都难以证实心脏c-kit+细胞的干性。Menasché等人报道在心力衰竭患者中,心脏c-kit+细胞实际上是肥大细胞(即肥大细胞,成熟的常驻组织白细胞)。Lee研究组使用了一种高度敏感的技术,多同位素质谱,来证明成年小鼠的心脏更新非常缓慢,每年大约1%,而这种更新完全可以由先前存在的心肌细胞的分裂来解释。该研究也证实了六十年代Rumyantzev研究组与九十年代Field研究组使用[3H]胸腺嘧啶测量心肌细胞DNA合成速率的研究结果。

  2014年,van Berlo等人发表了一项备受期待的研究,利用Cre重组酶对小鼠心脏c-kit+细胞进行谱系追踪。在这些小鼠中,通过注射他莫西芬,可以在表达c-kit的细胞中诱导一个可遗传的基因标记。在非给药时,可以追踪被标记的细胞。作者发现,在正常衰老或心肌梗死等损伤后,c-kit+心肌细胞形成水平低于万分之一,换句话说,没有证据表明c-kit+细胞是心肌祖细胞。尽管Anversa和合作者对这项研究的准确性提出了质疑,但其他小组提供了进一步独立的证据来反对c-kit+心脏干细胞假说,包括证明Sca-1+细胞也不是心脏祖细胞。

  Bergmann等人通过研究大气核武器试验产生的放射性碳与心肌细胞的结合,估算了人类心肌细胞的DNA更新速率。他们发现,平均而言,心肌细胞比个体的年龄稍年轻,估计20岁时的年更新速率为1%,50岁时为0.5%。这直接挑战了人类心脏是一个快速自我更新的器官的观点。Anversa的研究组很快反驳了这一报告,并重复了这项研究。他们的发现与Bergmann等人的发现直接相反,Bergmann等人的发现显示心肌细胞、血管细胞和结缔组织细胞的更新速率同样快(60年间为6-8次)。对这个领域的大多数人来说,这似乎是一个令人困惑的僵局;相反其实是一个戏剧性的突破摆在面前。

  放射性同位素碳测定法需要复杂的质谱分析,这两项研究都是由劳伦斯大学利弗莫尔国家实验室(LLNL)完成的。当Anversa小组的论文发表在Circulation杂志上时,LLNL的科学家们意识到,他们生成的原始光谱与Anversa小组在论文中报告的光谱之间存在差异。而正是Anversa小组中的这个差异支持了其关于人类心肌细胞快速更新的假设。于是,LLNL向美国国立卫生研究院研究诚信办公室报告了他们的担忧。

  随后,Brigham and Women’s Hospital发起了一项为期5年的调查,最终得出结论Piero Anversa、Jan Kajstura和Annarosa Leri犯下了广泛的科学不端行为。写这篇文章时,该医院宣布31篇论文将被撤回。完整的名单尚未公布,但irculation Research杂志和Circulation杂志最近也撤回了13篇论文。此外,NIH决定停止CONCERT-HF临床试验的注册。该机构和数据安全监测委员会正在审查这项研究的科学基础。

  未卜的挽救

  尽管发表在2004年的动物研究清楚地表明,骨髓细胞不能转分化为心肌细胞,然而其临床试验仍然继续有增无减。实际上,基于自体和异体细胞,包括骨髓间充质基质细胞、脂肪基质细胞以及之前讨论的心脏细胞的新的临床试验正在启动。但是,这些研究的科学依据已经完全改变了,从研究转分化为心肌细胞,到“旁分泌假说”即细胞在其新位点只能存活几天,并在死亡前会向周围受伤的心脏组织分泌未知的有益旁分泌因子。这假说的提出是为了调和CSCs在很大程度上并没有移植到心脏中,但在动物研究中确实对心脏功能有一些有益影响的发现。除了证明旁分泌作用可由培养细胞的胞外囊泡复制外,对其机制的研究很少。

  虽然对成体细胞临床试验的详细分析超出了这一观点,但我们也得到了一些经验。在对心脏功能或患者预后(如死亡率或再次住院)的影响方面,骨髓试验一直处于边缘、模糊或阴性的状态。两项独立的双盲安慰剂对照均未显示心脏功能有所改善。此外,技术错误最多的研究反而报道了最正面的功能影响,这表明严谨性的缺失可能会导致对于实验结果出现阳性解读。虽然心脏源性细胞的试验只有少数报道,唯一一项声称有益的研究来自于Anversa和Bolli研究组,也因为数据不规范,已被柳叶刀杂志标记为“表示关注”。 然而,要想继续合理化地研究下去,有效的方法是通过回顾性分析(例如,以发现从高细胞剂量中受益的群体为突破口),尽管这些研究从未被授权研究剂量增加对结果的影响,这也造成了如何挑选数据的难题。

  迟到的归责

  事后看来,对导致和延续这一科学和临床悲剧的环境进行仔细审查是必要的。这一事件的代价是巨大的:它浪费了原本可以用于支持更有前途的心脏修复技术的研究和临床试验的基金(可能是2.5亿美元);它对追求Anversa研究的一代年轻心血管医生和科学家产生了令人沮丧的影响;它动摇了公众对再生心脏病学的信心;最重要的是,它使成千上万的患者处于危险境地,利用虚假的研究获得以成体心脏干细胞为基础的心脏治疗得到了强有力的、令人信服的临床前证据,使得这些患者相信并接受了一项有风险的临床治疗。

  因此,所有有关机构都有责任仔细考虑如何通过执行更加专业和严格的程序以防止今后出现类似的错误。很显然,晚期心脏病人急切的临床需求,患者、医生和科学家不切实际的幻想促进了这一事件的发生。处于绝望中的病人是可以理解的,但是作为医生和科学家,我们除了有一腔热血外,更应该从专业的角度审视我们的研究,并在开始临床试验之前有充足严格的证据。同理,各院校在聘任教师时,也应从客观公正的外部专家那里获得意见和建议。成体细胞可进行心脏修复观点的支持者可以利用最新的干细胞技术,如谱系追踪,来阐明c-kit+细胞在早期的作用。而旁分泌假说在进入临床实验之前也应进行彻底的机制研究。

  另外,更正发表文章中的错误需要漫长的时间也指出了同行审查制度的重大缺陷。出版社对负面数据有强烈的偏见,越来越多的人倾向于发表宣扬突破性进展或打破常规结果的研究。许多情况下,被撤销的来自Anversa小组的研究都是由包括合作者在内的编辑小组进行审查或处理的,这是一种潜在的利益冲突。在其他情况下,短暂的投稿-接受周期(例如,从提交到接受只需要一天)引起了严格和独立的同行审查的问题。回顾过去,鉴于干细胞是跨领域和跨病种的技术,论文的发表以及教职的任命都应当听从心血管生物医学领域以外研究人员的意见

  科学政策在这一事件中也发挥了作用。2001-2008年,联邦对于hESC的经费进行了严格的限制,同时美国心脏协会采取了一项不资助hESC工作的政策,这项政策一直持续到今天。这些政策强调了成体干细胞适合作为再生治疗药物的观点,并对多能干细胞研究的整个领域造成了巨大的资金障碍。

  未来的道路

  这一事件警示我们要充分认识到心脏细胞治疗的多重挑战和复杂性。要想成功地将心脏细胞疗法应用于临床实践,需要解决科学-临床-资金中的重重困难,比如如何识别最佳细胞类型、如何在体内输送、如何进行长期观察、如何选择实验动物、如何建立临床标准、如何避免副反应等等。但是首先,必须有一个独立的、可重复的有效发现。

  目前,人心肌祖细胞或心肌细胞的唯一可靠来源是多功能干细胞。多个独立的实验室已经开发出几乎可以产生任何心肌祖细胞或亚型(心室、心房、起搏器)的方案。目前有证据表明,在包括灵长类动物在内的大型动物模型中具有明确的体内功能,以及初步的临床安全性数据。但这些研究仍处于早期,存在严重问题(如心律失常发生、免疫抑制、最佳给药、细胞纯化、可扩展性、批间变异、长期生存能力),然而这些问题都可以通过严格的实验来解决。对于研究人员来说,这意味着需要与生物制药行业建立伙伴关系。生物制药行业在监管、安全和毒理学方面拥有丰富的专业知识,并拥有严格的临床试验设计。这种实时的、交互式的协作可能比单独的学术努力更可取,同时这样也可以开发出一种全新的的治疗方案。

  多个独立实验室的早期实验研究已建立了新一代心脏修复和再生的策略,包括使用人类心脏祖细胞和从多功能干细胞中提取的心肌细胞;心脏贴片组织工程;利用蛋白、基因和修饰mRNA的旁分泌因子疗法;成纤维细胞向心肌直接重编程;释放细胞周期检查点促进心肌细胞复制等方法。虽然每种方法都有其固有的优点和缺点,但同样可以通过严格的实验来批判性地解决这些问题。

  目前,依然很难平衡心脏细胞疗法的前景、科学、监管和财政带来的挑战。然而,有一件事是清楚的,就像基因治疗和肿瘤免疫治疗一样,它需要跨学科的发现、长期的资助以及学术与企业的合作。如果心脏再生疗法能够坚持走科学的道路,也许我们真的可以为晚期心力衰竭患者提供新的希望。


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