发布时间:2018-06-21 17:17 原文链接: timsTOFPro和PASEF一双慧眼探究更多组学奥秘

  离子淌度技术发展几十年,布鲁克这个致力于挑战极限的公司,2016年一出手就推出业界最高淌度分辨的timsTOF质谱,在完成硬件的挑战后,布鲁克同德国马普研究所的Matthias Mann合作PASEF技术,于去年HUPO推出了timsTOF Pro,在蛋白质组学领域刷新了“鸟枪”法鉴定的速度、灵敏度和深度覆盖率的记录。今年ASMS上,分析测试百科网采访到布鲁克•道尔顿蛋白质组学副总裁Gary Kruppa博士,他将为我们进一步介绍timsTOF Pro的特性和用户的反馈,希望对广大的组学和精准医学研究的用户有启发……

在TimsTOF Pro前的合影:布鲁克.道尔顿蛋白质组学副总裁Gary Kruppa博士(右),分析测试百科网总经理卞利萍(左)

timsTOF Pro的特点和用户评价

  Gary博士首先回顾介绍了timsTOF Pro的原理和特点。离子淌度为LC-MS增加了除了液相保留时间、m/z外的新维度的分离,主要根据分子的形状和大小进行分离,为复杂体系样品的测定带来了巨大的想象力。但在蛋白质组学这种超复杂的体系测定中,淌度分离时间一般为30-100毫秒,该段时间内的淌度分离时间就不再能接受LC流出的样品,因此造成样品的丢失,离子利用率大打折扣。

  TIMS含义为:捕集离子淌度(trapped ion mobility),和传统离子淌度只依靠电场力不同,TIMS利用电场力和气流两种作用的协同效果,可在较小的淌度装置中获得更高的淌度分离能力。而timsTOF Pro创新性地使用了双TIMS分离/富集装置,离子在第一个TIMS部分中进行累积,然后在第二个TIMS中根据淌度进行分离,经过分离后的离子继续用于MS/MS碎裂。随后重复该步骤,在该过程中,当第二个TIMS进行分离时,第一个TIMS也同时在平行地累积离子,这样可以实现近乎100%的离子利用率。这种工作方式被称为PASEF(Parallel Accumulation Serial Fragmentation平行累积串行碎裂)技术,由Matthias Mann 发明【1】。

双TIMS工作模式:在气流Vg导向力和电场力E的共同作用下,离子根据其淌度被捕获在TIMS中进行累积,逐步降低电场力可序列地释放离子(最大碰撞截面积的离子先流出)到Q-TOF中做MS/MS。使用PASEF方法的双TIMS模式,离子在第二个TIMS中进行淌度分离时,第一个TIMS接收液相流出的样品继续进行累积,达到近100%的离子利用率

  关于用户的反馈,Gary博士谈到了三点:

  (1)提高灵敏度信噪比。在第二个TIMS淌度分离的100毫秒时间内,第一个TIMS持续累积离子,然后将离子压缩成一个几毫秒的包,迅速释放到第二个TIMS中,这种时间聚焦效应和色谱聚焦技术类似,进一步提高了信噪比。Matthias Mann最新发表的论文表明,这种时间聚焦效应可提高信噪比50倍。【2】很多早期的用户对timsTOF Pro大幅提升灵敏度的印象都非常深刻。

  (2)系统非常稳定皮实。据Matthias Mann最新发表的论文表明,在连续操作1年半的时间内,他们只清洗了离子传输毛细管,没有对离子源或其它装置做任何维护,系统一直保持高性能。

  (3)高灵敏度下的高速度。对于10ng的Hela酶解产物,仅用30分钟即可鉴定约2,500种蛋白。该性能对于样品量极少的蛋白质组学非常有吸引力,比如显微切割的肿瘤活检样品,尤其当结合了皮实可靠的快速液相系统后,非常适用于高通量的蛋白质组学临床应用。

  (4)高精度的CCS测定。在平行多次测定中,timsTOF Pro显示了极高的精度,CCS中位值绝对偏差仅为0.1%,比色谱保留时间的精度提高了10倍。CCS测定非常高的精度为基于谱库的识别开辟了新的途径,CCS参数在MS、MS/MS或非数据依赖的采集策略中增加了重要的证据。

  (5)大幅提升蛋白鉴定的数量和覆盖率。斯坦福大学中心实验室的对比试验表明,在肺、表皮、结肠、乳腺等组织的蛋白质组学测定中,timsTOF Pro的多肽匹配数量平均是Fusion的4.7倍。

  Gary博士总结了timsTOF Pro对蛋白质组学的贡献,timsTOF Pro上使用PASEF方法,凭借近100%的离子利用率,可以在母离子和子离子120Hz或更高的扫描过程中,在保持质谱超高分辨率的同时获得更高的灵敏度,大幅增加序列覆盖,并检测到更多的翻译后修饰和低丰度多肽。这对蛋白质组学的深入研究将产生巨大的推动作用。

中国的蛋白质组学研究:吸引更多学者归国 大幅采纳新技术

  谈到中美蛋白质组学客户的对比,Gary博士表示,“虽然我没有太多直接的经验,但可以看到的整体趋势是:中国大量投资于蛋白质组学、健康医疗和精准医学(个体化医疗),吸引了大量我周围的华裔科学家朋友们,回到中国开展蛋白质组学和精准医学研究。中国正在为蛋白质组学和健康医疗投入大量的设施、人员和仪器设备。我认为投入金额可能比一些西方国家的总量更大。”

  布鲁克质谱中国区高级商业总监王克非博士补充说,“我认为如今中美的差别很小,因为现在有很多国际合作计划。此前,美国科研人员会率先采用新技术,中国的科研人员常会等待新技术被证明成功后再开始采用新技术。但现在,越来越多的中国科研人员正在更多地开始早期的工作,他们正在尝试应用最新的技术,比如去年9月推出的timsTOF Pro在蛋白质组学的应用。 所以,目前中美科学研究的差别很小,尤其是在采纳新技术方面,几乎是同时的。”

  谈到对中美贸易战是否对质谱行业产生影响,Gary博士表示:目前尚未看到贸易战对质谱领域产生影响。我希望领导人们尽快停止贸易战,使我们可以继续自由贸易。如果真有威胁的话,将会导致各方的价格提高。因为就质谱来说,目前尚没有大量的质谱仪在中国制造,那么中国就会继续购买,购买价格就会上涨。如果世界范围内发生贸易战,布鲁克将为零部件等支付更高的价格,质谱仪购买国家也将支付更高的价格,贸易战只会提高每个人的价格。

进入临床质谱的前提:仪器的自动化和可靠性

  临床质谱应用目前是热门话题,中国质谱学会不久前亦成立了临床质谱专业委员会,Gary博士谈到了布鲁克质谱在此方面的特点,他表示:首先整套质谱系统要有很好的自动化和易用性;其次质谱必须非常皮实耐用。

  在timsTOF Pro中,离子从TIMS注入到Q-TOF时采用垂直正交设计,使后续质谱保持非常干净。如前文所述,Matthias Mann实验室在连续操作timsTOF Pro达1年半的时间内,只清洗了离子传输毛细管,没有对离子源或其它装置做任何维护,系统一直保持高性能。而市场上有些仪器可能随着时间推移性能下降,这也是布鲁克仪器在设计上很大的特色。

  在自动化方面,布鲁克与Evosep公司今年3月开展合作,timsTOF Pro同Evosep One高度自动化的分离装置集成,用于高通量临床蛋白质组学分析。Evosep One是一种新的用于大队列蛋白质组学的层析系统,优化的系统可进行每天200个样本的分析。例证显示,在5分钟的梯度中,它的液相色谱峰宽约2秒,已与 PASEF 方法集成在 timsTOF Pro质谱中,后者的MS/MS采样速度>150 Hz。新的组合提供了超高的灵敏度 (50ng HeLa) 和高通量,在5分钟梯度内,可高通量鉴定约1,200种蛋白,并实现对1,000个多肽的定量。对于大型样本群, 这使得生物标志物的研究和验证可达到每天200个样品的通量——这是临床蛋白质组学研究的一个突破。

布鲁克展厅内的Evosep One,用于大队列蛋白质组学的层析系

同客户合作创新 探究蛋白质组学更多奥秘

  谈及同客户的合作,Gary博士表示,PASEF的方法是德国马普研究所Matthias Mann教授提出的,布鲁克和Matthias Mann教授一同开发出了timsTOF Pro,这是同客户合作创新的典型案例。另外布鲁克和德国马普研究所的Jürgen Cox教授,合作开发了MaxQuant软件,这是一种质谱数据库搜索软件,可进行蛋白质鉴定、SILAC定量、iTRAQ/TMT定量和无标记定量等分析。在DIA非数据依赖的采集策略,蛋白质组学定量方面,布鲁克也在同客户合作创新,未来将发布更多成果。

  Gary博士表示, timsTOF Pro在蛋白质组学领域已展示出超乎人们想象的卓越性能,未来几年,布鲁克将围绕该仪器进一步研发,比如DIA非数据依赖采集,靶向蛋白质组学等,将为timsTOF Pro增加更多的重要新功能。

今年将在精准医学领域推新品

  最后,笔者请Gary博士谈谈布鲁克在精准医学中的规划。他表示,精准医学对于每一个质谱公司来说都非常重要,布鲁克将于今年推出更多新产品和软件。“这是另一项正在谈判中的合作,现在还不能公布。我们将在今年宣布该合作,并将我们的质谱转化为提供精准医学/个体化医疗服务的质谱。

  仪器是个体化医疗的最佳工具。个体化医疗意味着你必须在一段时间内监测个人尽可能的日常指标,你应该衡量一下,如果你想做基于个人蛋白质组的个体化医疗,你必须知道在正常情况下该个体的蛋白质组是什么,测量基础至少达到一个月,测定样品是一滴血,并保持监测一个月,然后你将看到该个体的蛋白质组在改变。技术的关键点包括:从一滴血中测到尽可能多的蛋白质,质谱系统要求高灵敏度,高的序列覆盖,并必须皮实可靠,可以每天测定数以百计的样品。这是真正的目标。

  我们可以测量个体的基因组,但基因组是不变的,它不能告诉你是否生病,而只能告诉你患病的倾向。因此你必须测定蛋白质组、代谢组,告诉你产生何种变化时你会生病。你可以定期测量蛋白质组、代谢组,这样你可以获知发生改变的时间。

  因此,在精准医学/个体化医疗方面,需要高通量、高灵敏度的质谱技术,timsTOF Pro正是理想的仪器之选。

  参考文献:

  [1] J.Proteome Res. 2015,14,5378-5387, Parallel Accumulation – Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device

  Florian Meier, Scarlet Beck, Niklas Grassl, Markus Lubeck, Melvin A. Park, Oliver Raether, and Matthias Mann

  [2] Online parallel accumulation – serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Matthias Mann等

  bioRxiv, June 1, 2018 https://www.biorxiv.org/content/early/2018/06/01/336743.full.pdf+html

  采访人简介:

  Gary Kruppa 博士是一名化学家,拥有超过38年的质谱研究经验。作为蛋白质组学业务的副总裁, 他目前负责布鲁克·道尔顿公司质谱在蛋白质组学的应用、应用开发和市场管理。2008-2016年,他作为布鲁克业务发展副总裁,曾负责多方面的业务开发,包括首次向美国临床微生物学实验室市场和后来的制药微生物学质控实验室引入MALDI Biotyper。 在此之前, 他于1991年加入布鲁克公司,于1998-2008年担任布鲁克副总裁。1982年,他获得了特拉华州大学化学学士学位,1988年获加州理工学院化学物理博士学位。

  关于布鲁克公司(纳斯达克股票代码:BRKR)

  布鲁克正在帮助科学家们取得突破性发现并开发新的应用来提高人类生活质量。布鲁克的高性能科学仪器和高价值分析及诊断解决方案使科学家能够在分子、细胞和微观层面探索生命和材料。

  在与客户的密切合作下,布鲁克致力于在生命科学分子研究、应用市场和制药应用、显微镜和纳米分析、工业应用、细胞生物学、临床前成像、临床表型组学和蛋白质组学研究以及临床微生物学。 欲了解更多信息,请访问:www.bruker.com

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