微生物样品的处理方法

一、初级（初始）样品混悬液

样品通过称取一定重量后或量取一定体积后，加入9倍重量或体积的特定稀释液，经过外力作用充分均质混匀后，得到悬浊液、溶液或者乳浊液。

有的初始混悬液中含有较大的样品颗粒时，应将其水平静置沉淀。这样得到的是初级(初始)混悬液(10-1)。

二、次级十倍梯度稀释

取一特定体积的初级混悬液，加入9倍特定体积的稀释液充分混匀，这样就将初级混悬液进行了十倍稀释操作(10-2),然后依次再进行下去(10-3，10-4....10-n),得到一系列的稀释液，直至得到满足目标微生物培养要求的稀释液。这样的操作叫次级十倍梯度稀释，得到的一系列稀释液被统称为次级十倍梯度稀释液。

三、稀释操作的原则

初级混悬液的制备是为了让样品中的微生物尽可能均匀分布，然后在接下来的次级十倍梯度稀释液中，微生物的数量能按指数进行均匀规则的递减，这样通过培养之后，方便用于菌落计数操作。

为了严格每一个稀释度的计数范围，提高计数的准确性，应先对样品的微生物污染程度做一次大体的评估，然后至少选取合适的两个连续稀释度的稀释液，每个稀释度至少接种两个培养基平板进行培养。无论是初级样品混悬液还是次级十倍梯度稀释样品溶液，都应振荡均匀，保证其微生物在溶液中均匀分布之后再进行接下来的操作。

振荡时应该在涡旋混和器上进行(见图)。用右手拇指和中指夹紧试管，右手食指抵住试管帽，防止振动时试管帽飞出，三个手指用力将试管底部顶住涡旋混和器的橡胶振动头上。涡旋混和器运转时通常有两档：一个是振动头持续振动，一个是只有物品顶住振动头才会振动，通常选用后者。如果没有涡旋混和器，可以采用手心振动混匀的方法。

四、稀释液

⒈配制稀释液的通常原则

为了使结果更具可重复性，建议配制稀释液时，无论用脱水的单种试剂逐一称量配制还是使用脱水的商业成品培养基，实验室人员在配制稀释液时必须严格按照以下原则：

(1)配制稀释液的各种试剂或脱水成品培养基干粉一定要保证质量。

(2)配制稀释液的水必须是合格的蒸馏水，水的各项指标(pH、水活度、电导率、电阻率、菌落总数)必须符合培养基配制用水的要求。

(3)稀释液各组分必须充分溶解形成均一溶液，无沉淀。稀释液配好之后， pH要满足目标微生物的存活要求，特别是稀释液经高压灭菌之后的pH, pH误差的正常范围应在±0. 2 (25 ℃时)。

⒉普通稀释液

常用的普通稀释液有浓度为0.1%、 pH6.8~7的灭菌蛋白胨水(按蛋白胨1.0g,氯化钠8.5g,蒸馏水1000 mL的比例混和至完全溶解),磷酸盐缓冲液， 0.85%的氯化钠溶液， 2%的缓冲蛋白胨水等。有时会因具体情况加入一些添加剂，例如对于脂肪含量高的样品会加入乳化剂、表面活性剂；对于均质操作时容易起泡沫的样品会加入泡沫抑制剂、消泡剂等。

在制备初级样品溶液时，由于样品的含量占整个溶液系统的比例较大，样品可能会改变稀释液的性质，特别当样品中难溶于水的物质占较大比例时，样品在稀释液中的溶解度会受到影响。此时会影响到溶液的pH或者水活度(Aw),所以当无法确定样品是否对稀释液产生这种影响时，应测定第一个稀释度的pH和水活度。可以在稀释液中加入磷酸盐缓冲液来稳定pH的变化。

特别注意的是，对于一些高溶解度的干燥样品(奶粉、婴儿食品)制成初级样品溶液时，水活度非常低，所以应选择蒸馏水作为稀释液。针对不同样品，选择最适合的稀释液，这其实需要通过一系列的试验得到，所选择的稀释液应该具有高的复苏率。
样品的稀释液制备过程，应该在30 min内完成。

⒊针对厌氧微生物的稀释液

对食品中厌氧微生物进行定性或定量检测时，必须把氧化作用降到最低，稀释液应具有抗氧化作用。制备样品溶液时，应尽量避免氧气进入。检测对氧气极其敏感的厌氧菌时，除了使用适当的稀释液外，还要具备一些特殊设备作为辅助，比如用厌氧工作站来作为菌体的防护措施来操作。

⒋中和类稀释液

有些样品中含有抑菌物质、消毒剂等杀灭或抑制微生物的成分。需要加入某些有机或无机化合物与这些成分作用进行中和，消除其影响。

对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在稀释液中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在稀释液中加入3% (质量浓度)吐温-80和0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在稀释液中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在稀释液中加入3% (质量浓度)吐温-80,以中和被检样液的残效作用；

针对大蒜泥、大蒜粒、大蒜粉、洋葱粒等这类样品，由于样品中会含有抑制细菌生长的成分，可以采用D/E中和肉汤。

⒌嗜盐菌、嗜渗菌稀释液

研究嗜盐菌(如：食盐样品),应采用15%的无菌氯化钠溶液作为稀释液。嗜渗菌计数时，可以用20%的无菌蔗糖溶液作为稀释液，这样做的目的是为了保护菌体，因为普通的稀释液对于这类菌来说，由于液体渗透压过大，菌体会因液体的渗透作用膨胀破裂，导致菌体死亡无法进行培养和计数。这就需要与之相适应的无菌高渗溶液作为稀释液，避免因渗透作用导致菌体死亡。

五、稀释液的分装和灭菌

将稀释液分装至适宜制备初级混悬液的容器内，容器体积应大小合适，不能太小，防止高压灭菌时液体溢出。

将稀释液分装至进行十倍梯度稀释的试管内，一般每支试管装9mL稀释液，灭菌之后，每支试管内的稀释液体积变化应在±2%以内。

对某些微生物计数时，会用到一些不同的培养基，或许在分装用于这些微生物的稀释液(或其中一部分稀释液)的体积远大于9ml,这种情况下，装这些稀释液的试管或烧瓶应按实际的装液量进行合理选择。

将装好稀释液的烧瓶或试管用配套的塞子塞好。一般稀释液的高压灭菌条件是121℃，15 min。

应特别注意灭菌前后稀释液的pH变化，某些稀释液或培养基在灭菌之后， pH会降低。因为pH的变化对目标微生物的生物活性会造成影响，同时也是人工操作中很容易被忽视的一个环节，除了使用精度pH试纸以外，最好能配备一台pH电子测量计，误差为±0.1个pH单位之内。