westernblot实验经验总结（一）

做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，其实发现WB想要做好并不难，总结了WB实验中可能会遇到的问题，分析了可能的原因及对应的解决方案，希望能成为你实验成功的基石。

问题1：转膜不充分

(1)膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol浸透膜。

(2)靶蛋白分子量小于10 000

选择小孔径的膜，缩短转移时间。

(3)靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值

可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。

(4)甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

(5)转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

问题2：背景高

(1)膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol浸透膜。

(2)洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数。

(3)阻断不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

(3)二抗浓度过高

降低二抗浓度。

(4)检测过程中膜干燥

保证充分的反应液，避免出现干膜现象。

(5)曝光过度

缩短曝光时间。

(6)抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。

问题3：没有阳性条带

（1）抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

（2）酶失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

（3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

（4）试剂不匹配

一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。

（5）一抗失效

选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液。

（6）HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。