献给初学者：PCR常见问题分析

　　我们给大家汇总了 PCR 常见问题、出现的原因及解决对策，还有终极解决方案。

　　PCR 常见问题及解决方案

　　1没有扩展条带

　　可能的原因及对应的解决方案如下：

　　 酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

　　 模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

　　 变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

　　 反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。

　　 引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

　　 引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

　　 DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。

　　2PCR 产物量过少

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　 退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

　　 DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

　　 PCR 循环数不足。增加反应循环数。

　　 引物量不足。增加体系中引物含量。

　　 延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

　　 变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。

　　 DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净

　　3扩增产物跑电泳条带弥散

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　 酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

　　 dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。

　　 MgCl₂ 浓度过高。可适当降低其用量。

　　 模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。

　　 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。

　　 循环次数过多；增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的 PCR 循环。

　　 退火温度过低。

　　 电泳体系有问题：

　　①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

　　②凝胶没有凝固好；

　　③琼脂糖质量差。

　　 若为 PCR 试剂盒则可能：

　　①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

　　②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

　　 降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

　　4扩展产物出现杂带

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　 引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

　　 循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

　　 酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

　　 退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

　　 样品处理不当。

　　 Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。

　　 若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

　　 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

　　 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

　　 引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

　　 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

　　 模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng，而基因组 DNA 则应<200 ng。

　　 外源 DNA 污染。确保操作的洁净。

　　5条带大小与理论不符

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

　　 模板或引物使用错误。更换引物和模板。

　　 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。

　　6阴性对照出现条带

　　可能的原因和对应的解决方案如下：

　　 试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。