新冠病毒又出新的检测技术？病毒检测专家为你解答！

　　检测，对于疾病防控就具有重大意义。美国的新冠检测，从开始每日检测数十人到如今每日检测近100万人！

　　随着检测量不断增长，检测的技术也在快速进步，截止2020年8月6日，已经有168个分子检测手段被美国FDA批准可以在紧急状态下（emergency use authorization，简称EUA）使用。

　　霍普华丰采访了约翰·霍普金斯工程学院的病毒检测专家，陈立本博士，分析目前的新冠检测技术，也了解到了约翰·霍普金斯目前检测技术发展情况的一手信息。

　　项目由霍普华丰新冠研究小组策划，成员包括陈立本博士、陈峰浩博士、李海波博士、李思轩和于在宽博士。鸣谢：霍普华丰宣传组聂健怡采访和撰稿、刘秀云博士编辑；Xuwei Hou博士提供 scientific illustration视频。

　　专家简介

　　陈立本博士/约翰·霍普金斯大学副研究员

　　陈立本博士是约翰·霍普金斯大学的病毒检测专家。 他于2005年从华中农业大学获得兽医学学位，于2010年获得中国农业大学博士学位。在加入约翰·霍普金斯大学之前，曾在北京动物疾病预防控制中心任职，主要工作是开发动物传染病的快速诊断工具。 陈博士于2015年加入约翰·霍普金斯大学工程学院，致力于研究快速诊断细菌和病毒感染的技术平台。

　　陈博士是Jeff Wang教授实验室的研究员之一，该团队致力于开发流行病领域的可以在护理点实现的检测技术，如对艾滋病、淋病的检测。

　　面对本次新冠疫情，团队决定用自己的专长来协助抗疫。该团队开发的技术能实现低成本的简易操作，在一台仪器中自动化样本处理（核酸提取和纯化）、核酸扩增、信号检测三个步骤，只需 1-2 步手动操作即可完成检测过程。团队目前在积极寻求FDA审批，希望能早日获得EUA来加快新冠检测。

　　检测技术详解

　　目前的新冠检测技术主要分三大类，抗体测试，核酸测试和抗原测试。

　　这三种技术的诊断目的是不同的：

　　抗体测试是通过检测被测试者体内是否有相关抗体来判断被测试者是否曾感染过病毒，多用于流行病学普查，也有利于事后发现无症状感染者，并不能作为确诊的标准。

　　核酸测试是通过检测病毒的核酸（RNA）来判断测试者体内目前是否正携带病毒；

　　抗原测试通过检测样本中是否有病毒上或病毒内发现的蛋白质片段来进行诊断，因此它和抗原检测都是对于潜在感染者的确诊。

　　抗体检测

　　免疫学（抗体）检测主要包括快速诊断测试（RDT），酶联免疫吸附测定（ELISA），中和测定和化学发光免疫分析。这种检测技术具有操作简便，快速的特点，非常适合Point-of-care的快速检测。

　　其中，RDT速度最快，只需10-30分钟就能判断结果。但RDT只能用于定性判断病人血清中是否存在病毒抗体，而其他方法均可对抗体滴度进行定量分析。ELISA和化学发光免疫分析分别需要2-5小时和1-2小时出结果，却不能判断血清中的抗体是否能有效抑制病毒复制。中和测定则解决了这一弊端，可以检测出血清中能抑制病毒生长的活跃抗体，需3-5天出结果，但也可能遗漏与病毒复制过程无关的抗体蛋白。

　　目前获FDA的EUA批准的RDT有Anti-SARS-CoV-2 Rapid Test，DPP COVID-19 IgM/IgG System，qSARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid Test；ELISA有Mount Sinai Laboratory的COVID-19 ELISA IgG Antibody Test，DiaSorin Inc.的LIAISON SARS-CoV-2 S1/S2 IgG，和Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.的VITROS Immunodiagnostic Products Anti-SARS-CoV-2 IgG Reagent Pack。

　　与核酸检测相比，免疫学检测要简易得多

　　1. 标本采集。一般只用血液。简单，容易标准化。

　　2. 样本处理。一般无需样本前处理。

　　3. 信号检测。一般采用酶标法或胶体金法。通常肉眼可见，无需仪器或简单仪器。

　　4. 数据分析。简单，一般定性或半定量。

　　免疫学检测技术最大的问题是灵敏度和特异性的问题。目前也没有一个公认的“标准品”对新方法进行准确评估。

　　核酸检测

　　核酸检测为目前的主要确诊方式，涉及五步：标本采集、样本处理（核酸提取和纯化）、被检物（核酸）扩增、信号检测、数据分析。我们针对以上五个环节对目前EUA名录中的方法进行一下对比分析。

　　Step 1：样本采集

　　呼吸道采集

　　包括鼻咽标本（nasopharyngeal specimen）、口咽标本（oropharyngeal specimen）、鼻拭子标本(nasal swab)、鼻咽冲洗/吸出物（Nasopharyngeal wash/aspirate)或鼻冲洗（nasal wash/aspirate）标本，取样麻烦，对操作的精确度要求较高，需要专业技术人员操作，不易实现在家操作。绝大部分EUA采用这一方法。

　　口腔唾液采集

　　简单，可以病人自己采集。前期研究表明唾液病毒含量低，但近期的多项研究证明唾液载毒量与拭子相当。已经得到EUA批准的Spectrum Solutions LLC SDNA-1000 Saliva Collection Device，就是在样本采集步骤的创新，实现了可以通过提取唾液来进行检测。目前拥有EUA的可以处理检测唾液标本的技术只有Rutgers Clinical Genomics Laboratory的TaqPath SARS-CoV-2-Assay，也因此使其成为目前唯一能应用于家中采集标本的检测技术。

　　支气管肺泡灌洗液（BAL fluid）、痰液采集等

　　不适合广泛采用（BAL灌洗是一种微创手术，也不是所有患者都有痰液）。

　　“唾液采集能够实现在家取样，让采样更容易，更有利于普及检测” 陈立本博士评价说，“同时因为节省了标本从采样点运送到实验室的时间，缩短了Turn-around-time（周转时间）。 “

　　Step 2: 样本处理

　　样本处理（核酸提取和纯化）是核酸检测中最复杂的一步，目前主要分三类：手动、实验室自动型，Point-of-care 自动型。手动提取速度慢，而自动化样本处理成本很高。Point-of-care 自动型往往集样本前处理-上样-核酸扩增-数据采集和分析为一体，可以在现场完成，不受时间、地点限制。

　　手动处理

　　使用ＲＮＡ提取试剂盒，需要离心，清洗等冗长的手动操作，单次能处理一个或多个样本。

　　实验室自动处理

　　全自动的移液机器人（pipetting robot），单次能处理上百个样本，通量高，但机器十分昂贵。使用此类技术的检测包括罗氏（Rochecobas SARS-CoV-2，检测限度0.009 TCID50/mL，约9-90 copies/mL）、Qiagen的QIAstat-Dx Respiratory SARS-CoV-2 Panel（检测限度500 copies/mL）。

　　Point-of-care 自动型 （CLIA waived）

　　单次一般只能处理一个样本，相对成本较低。这类技术可实现现场检测、而无需将样品送出到指定实验室检测，能够加快检测结果的读取速度。目前只有丹纳赫Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2（检测限度250 copies/mL），雅培的 ID NOW（检测限度125 copies/mL）, Mesa Biotech 的 Accula SARS-Cov-TEST （检测限3000 copies/mL）, Cue Health Inc. 的 Cue（检测限度1300 copies/mL）四个EUA产品获得了CLIA waiver。丹纳赫Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2是少有的完全使用了自动化的核酸提取和纯化的技术，因此检测速度较快，能在一小时内于采样现场完成样品-结果的全过程。遗憾的是，后两个产品都陆续被报道临床假阴性率较高。Health Inc. 的Cue刚获批不久，目前还没有足够的临床数据用来评估它的准确率。

　　Step 3: 核酸扩增

　　PCR

　　灵敏度高，但需要高精度的升降温控制，反应时间长。绝大多数EUA采用此方法。其中比较特别的是Bio-Rad SARS-CoV-2 ddPCR Test，和Gnomegen的COVID-19 RT-Digital PCR Detection Kit使用的Digital PCR仪器，可用作绝对定量。但PCR技术操作十分复杂且需要多台昂贵的仪器，而且时间较长，如Bio-Rad ddPCR Test hands-on time超过2小时，而instrument time则超过7小时，因此较难在临床上普及推广。

　　恒温扩增

　　无需高精度升降温控制，反应快。如Sherlock CRISPR SARS-CoV-2采用LAMP技术，ID-NOW采用NEAR技术。但遗憾的是运用这类技术的几个产品灵敏度都较低。

　　Step 4-5: 信号检测和数据分析

　　信号检测和数据分析方法取决于扩增技术的选择。绝大多数基于PCR的方法均采用TaqMan探针技术，在扩增的过程中产生实时荧光来确定被检样本中核酸浓度。Mesa Biotech 的 Accula SARS-Cov-TEST则采用层析试纸条显色来判断结果（但灵敏度比探针法差一个数量级）。比较特别的是5月得到EUA批准的Sherlock CRISPR SARS-CoV-2试剂盒，在信号检测步骤运用了其ZL的基于CRISPR的Sherlock技术，来取代传统TaqMan探针。但与传统基于探针的PCR技术相比，Sherlock CRISPR SARS-CoV-2检测技术在易用性和灵敏度方面并没有体现出优势。“Sherlock的最大问题是需要太多的吸液步骤（pipetting）以及RNA扩增后之后需要开盖加入Sherlock信号检测试剂，大大增加污染的概率。”陈立本博士评价说道。Sherlock CRISPR SARS-CoV-2试剂盒可适用于各类呼吸道采样标本，人工进行核酸提取和纯化后，使用LAMP的恒温PCR技术扩增核酸，再用Sherlock 技术进行信号检测。其检测限度为6300 copies/mL，灵敏度远低于大多数其他现有技术。

　　对于任何一项新冠病毒诊断方法来说，以上五个步骤缺一不可。每一个分子诊断方法都是针对该五步中的一个或多个步骤进行技术开发，再与现有技术整合，来形成一套检测系统。各个环节技术的特点决定了检测的速度、灵敏度、和检测操作的复杂程度。

　　抗原检测

　　前面提到，抗原测试通过检测样本中是否有病毒上或病毒内发现的蛋白质片段来判断患者是否携带病毒。这一检测的最大优势在于速度快，可以在几分钟内出结果，并且由于其操作简便、成本较低，非常利于后期大规模推广检测。但是，抗原检测灵敏度不如核酸检测，可能会遗漏一些感染，出现假阴性问题。也就是说，抗原检测的阳性结果准确性极高，但是得到阴性结果也并不能排除感染的可能性。5月8日FDA EUA批准的Sofia 2 SARS Antigen FIA备受关注，因为其简单快速，同时也获得了CLIA waiver （可用于point of care）。其检测灵敏度只有113（干拭子标本）-850（3mL transport medium洗脱后的标本）TCID50/mL，大概相当于105-106 copies/mL。

　　总结

　　最后，陈博士对各种技术做了总结：

　　“最理想的用于诊断的新冠检测技术应当是能实现快速大批量、高精度的检测，目前的各个技术都各有优劣。

　　其中全自动PCR系统（如罗氏的cobas系列）具有高通量的优势，可以一次检测上百个样品，但是机器价格十分昂贵。

　　相比较而言POC检测方法（如雅培的ID NOW，丹纳赫的Cepheid Xpert）操作简单、速度快、一次性投入低，适用于在护理点对疑似病例的确诊，但是只能逐个样本检测，准确性相比实验室全自动系统较低。

　　未来的技术应该是结合上述两者优势的具有快速、准确、自动化、价格低廉的POC检测甚至是居家检测。”