在大多数严重的急性呼吸道感染病例中,RNA病毒是主要病原体,如2019年12月以来的新冠病毒(SARS-CoV-2),已导致全球超过400万人感染,超过30万名患者死亡[1,2]。mNGS因无需培养、不依赖核酸序列、无偏好广覆盖的优点,在临床疑似新发病原体、罕见病原感染、急危重症、未知原因发热等患者病原检测应用有较多案例报道,国内专家共识推荐使用[3]。但是这种实验室自建检测方法由于缺乏方法标准化和实验室分析性能和临床性能的确认,阻碍了该方法在临床的应用普及[4]。

来源:medRxiv

  首都医科大学陈德喜教授团队基于illumina Nextera XT Tn5转座酶直接切割RNA/DNA杂合链的特性[5],优化mNGS建库方法,并在NextSeq 500平台上对该方法在临床检测呼吸道RNA病毒的各项性能指标进行了确认,包括低检测限、精密度、稳定性、抗干扰能力以及SARS-CoV-2病毒检测准确性等,为mNGS临床实验室常规检测应用提供了数据参考和支持。5月14日,该研究成果发表在预印本medRxiv上[6]。

  一般mNGS的RNA检测流程包括逆转录、二链cDNA合成、预扩增/等温扩增、cDNA片段化和PCR扩增等流程[7]。研究团队通过优化RNA建库步骤、缩短建库时间,使mNGS操作简便,更适合临床使用。该团队将这种简便、快速、高灵敏度的检测方法命名为CATCH(pathogeniCrnA/dna hybrid Tagmentation teCHnology)。CATCH可跳过二链cDNA合成,通过优化延伸和PCR步骤,将整个文库制备过程缩短为3小时,人工处理时间为35分钟(图1)。该方法对SARS-CoV-2的检测限为39.2拷贝/test,A型流感病毒为278.1拷贝/mL,其重复性、稳定性和抗干扰性都表现出了较好的性能(表1)。

图1. CATCH工作流程示意图。来源:medRxiv

表1. CATCH对A型流感病毒和SARS-CoV-2的检测性能特征。来源:medRxiv

  该方法理论上可以多重检测所有RNA病毒,研究团队选取了7种常见呼吸道RNA病毒,在接近检测下限处设置病毒载量基线,基于健康人咽拭子VTM基质模拟7种病毒混合样本,验证了该方法的鉴别检测能力。结果发现,CATCH不仅可以精确的鉴别7种病毒,并能对A型流感病毒进行亚型区分(图2),研究还发现mNGS检测信号与病毒浓度具有显著相关性,说明该方法还可以达到半定量的效果(图3)。

图2.CATCH在RNA病毒检测中的应用。(B)7种典型呼吸道RNA病毒:A型流感病毒(A / 2009 / H1N1)、B型流感病毒(B / Vitoria)、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒的鉴别检测和半定量。(C)3种典型的A型流感病毒亚型的鉴别检测和半定量。来源:medRxiv

图3.(B)qRT-PCR ORF1ab基因Ct值和mNGS检测病毒信号的比较。(C)qRT-PCR N基因Ct值和mNGS病毒信号的比较。来源:medRxiv

  研究团队回顾性的纳入了北京佑安医院疫情期间的64位COVID-19患者的98个RNA样本,同时采用CATCH和qRT-PCR两种方法检测。在47个双基因阳性的qPCR结果中,44个mNGS检测阳性的样本中存在SARS-CoV-2信号。在11个单基因阳性样本中,5个样本中可检测到SARS-CoV-2。此外,在40个qPCR检测为阴性的样本中,mNGS检测结果仍为阴性。在这些样本中,没有其他DNA或RNA病毒被检测为阳性。

  总体而言,与qRT-PCR临床检测结果相比,CATCH的总体准确度为91.4%,灵敏度为84.5%,特异性为100%。如果仅考虑双基因阳性样品,其灵敏性将提高到93.7%(图4)。由于各种原因,临床样本的核酸浓度成为制约mNGS的因素之一。研究团队发现有相当一部分样本提取RNA低于qubit检测下限(65%,38.5%),无法满足以往的mNGS建库方法需要的起始量。CATCH方法可以超低起始量建库,对于低于qubit检测下限的RNA建库样本,成功率仍为100%。

图4. CATCH与qRT-PCR检测SARS-CoV-2的性能比较。来源:medRxiv

  据悉,该研究为首次对基于Tn5转座酶RNA快速建库mNGS方法进行的分析性能确认。准确可靠的临床性能验证是mNGS作为常规诊断检测推出之前必不可少的环节。该团队期待其研究工作能够为同行提供mNGS在临床开展所需要的具体方案和详实的数据,为mNGS病原检测真正走进临床助力。

  参考文献:

  [1] Zhu N, Zhang DY, Wang WL, et al. A Novel Coronavirus from Patients withPneumonia in China, 2019. N Engl J Med 2020; 382:727-33.

  [2] Wu F, Zhao S, Yu B, et al. A new coronavirus associated with human respiratorydisease in China. Nature 2020; 579:265-+.

  [3] 宋振举等.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J].中华急诊医学杂志,2019, 028(002):151-155.

  [4] Han D, Li Z, Li R, et al. mNGS in clinical microbiology laboratories: on theroad to maturity[J]. Critical Reviews in Microbiology, 2019(3):1-18.

  [5] Di L, Fu Y, Sun Y, et al. RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNAhybrids. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(6):2886‐2893.

  [6] Laboratory validation of an RNA/DNA hybrid tagmentation based mNGS workflow on SARS-CoV-2 and other respiratory RNA viruses detection, medRxiv, May 14, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.20099754

  [7] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinicalmetagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid.Genome Res 2019; 29: 831-42.

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