发布时间:2021-09-01 14:06 原文链接: 综述|AD的蛋白质组学格局发病机制和生物标志物新见解

  导 读

  基于质谱的蛋白质组学使得对阿尔茨海默症(AD)的蛋白质组和蛋白质翻译后修饰(PTM)的深入剖析成为可能。在这里,我们回顾了AD蛋白质组学研究的历史和近期的进展以及局限。作为遗传图谱的补充,蛋白质组学研究不仅验证了典型的淀粉样蛋白和tau通路,而且还发现了蛋白质网络中的新组成部分,如RNA剪接、发育、免疫、膜运输、脂质代谢、突触功能和线粒体活性。7个深层数据集的Meta分析显示,AD脑蛋白质组(n=12017个蛋白质/基因)中有2,698个差异表达(DE)的蛋白质,覆盖了35个已报道的AD基因和危险位点。DE蛋白含有富含神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和上皮细胞的细胞标志物,支持多种细胞类型参与AD的病理过程。我们讨论了选定DE蛋白的假设保护作用或有害作用,强调“淀粉样蛋白组”(淀粉样斑块中的所有生物分子)和疾病进展中的顶级蛋白。全面的PTM分析代表了AD中的另一层分子事件。特别是,tau PTM与疾病分期相关,表明AD患者个体的异质性。此外,脑脊液和血清等生物体液具有前所未有的蛋白质组学覆盖范围,并且荟萃分析可获得新的AD生物标志物。因此,蛋白质组学驱动的系统生物学为将基因型、蛋白类型和表型联系起来提供了一个新的领域,加速了改进的AD模型和治疗策略的发展。

  论文ID

  原名:Proteomic landscape of Alzheimer’s Disease: novel insights intopathogenesis and biomarker discovery

  译名:阿尔茨海默症的蛋白质组学格局:发病机制和生物标志物发现的新见解

  期刊Molecular Neurodegeneration

  IF:14.195

  发表时间:2021.08

  通讯作者:白冰

  通讯作者单位:圣裘德儿童研究医院结构生物学系

  内容

   1.背景

  阿尔茨海默症(AD)是一种与衰老相关的神经退行性疾病,作为痴呆症最常见的形式,在美国大约有580万人受到折磨。据估计,全世界有5000万人患有阿尔茨海默氏症和其他类型的痴呆症。随着人口逐渐老龄化,AD给美国医疗保健系统带来的经济负担目前为3050亿美元,在不久的将来还将大幅增长。典型的AD发病发生在65岁之后(晚发性AD,LOAD),尽管不到5%的AD病例出现在早期(早发性AD,EOAD),而1-2%的AD病例是在家族内遗传的(家族性AD)。该病的主要临床表现包括严重的认知功能减退、进行性记忆丧失、逆行性和顺行性健忘,并伴有严重的组织病理学改变,如海马退化和随后的皮质物质丢失。AD通常表现为额外的合并症,如运动和心理障碍,以及各种睡眠障碍。这些不同的症状在某些情况下混淆了AD的诊断。广泛的分子研究揭示了这种疾病的病理特征:由淀粉样蛋白(Aβ,Aβ)多肽组成的淀粉样斑块,以及含有过度磷酸化tau的神经纤维缠结(NFT)可用于疾病分期(如Braak分期)。尽管几十年来人们积极研究药物开发,以及最近有争议的阿杜卡努单抗(也被称为Aduhelm)用于AD治疗,但这种大脑退化的确切原因还没有完全弄清楚,这种毁灭性疾病的治愈仍是遥不可及的。

  对AD发病机制的基本认识来自于互补的遗传/基因组和生化/蛋白质组学研究。1984年,Glenner和Wong从AD患者的斑块中分离出一种β肽,后来对其进行了部分测序,随后促使了β-淀粉样前体蛋白(APP)的基因克隆。这一生化发现后来得到了致病AD基因的基因突变图谱的证实,包括1991年的APP和1995年的早老素(PSEN1/PSEN2)。生化和遗传学证据的结合证实了AD的一种直观的分子机制,即APP被β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(含PSEN1/PSEN2)依次水解产生淀粉样蛋白Aβ肽。综上所述,这些结果引出了淀粉样蛋白假说,认为APP裂解的Aβ物种在推动AD发病中起着中心作用。同时在1986年左右,人们证明过度磷酸化的tau是AD脑组织中神经原纤维缠结的主要成分。Tau基因(MAPT)的突变与其他几种神经退行性疾病有关,如额颞叶痴呆(FTD)。生化和遗传学证据再次确定了tau假说,并强调了tau在AD进展中的关键作用。本世纪初的实验表明,Aβ在认知缺陷之前聚集,后来下游tau积累会引发神经毒性。目前的研究范式已经从Aβ沉积转向了解不同Aβ形式的毒性,特别是可溶性Aβ寡聚体。错误折叠的Aβ和tau也可能在神经变性过程中作为“病态种子”传播。

  人们假设了无数的其他模型:胆碱能,钙,线粒体,膜运输,炎症,淋巴,微生物感染,神经血管和细胞相假说,然而这些替代性的概念与淀粉样蛋白和tau理论框架仍然难以区分。事实仍然是,Aβ可能是导致AD的必要因素,但不是充分因素。然而,介导A-β和tau毒性的分子途径、细胞回路和病理生理机制尚不完全清楚。

  基因组学和蛋白质组学中大规模测序技术的创新加速了AD领域的发现。除了APP、PSEN1和PSEN2,早在1993年的遗传学研究中人们就发现了APOE4是AD的主要风险基因。目前的高通量遗传/基因组分析揭示了新的风险基因,如TREM2和unc5C,以及160多个可能与淀粉样蛋白、tau、内吞和免疫相关的风险位点。2014年,美国国立老龄研究院发起了加速药物伙伴关系(AMP)-AD计划,利用学术界和工业界的多学科战略,旨在发现新的治疗靶点和生物标志物。多组学方法为理解AD的复杂性提供了一个不可或缺的系统工具。虽然AD遗传学领域在过去几年中已经被大量综述,这里我们打算回顾AD蛋白质组学领域。在PubMed的文献库中搜索关键词“阿尔茨海默氏症或阿尔茨海默氏症”和“蛋白质组学或蛋白质组”,出现2000多篇出版物,尽管AD蛋白质组学是在本世纪初才出现,但2020年有300多篇论文,并且一直在稳步增长。最近的许多工作致力于描绘大脑深层蛋白质组、分析大样本并解剖亚蛋白质组、研究复杂的PTM模式、并在生物液中鉴定新的候选生物标志物。我们讨论了蛋白质分析技术和应用的历史、现状和未来,并通过荟萃分析提供了AD蛋白质组学的整体格局,揭示了AD发病机制和潜在生物标志物的新见解。

  2.蛋白质分析和质谱技术的发展

  本综述概述了上个世纪对基于质谱(MS)的蛋白质分析作出贡献的主要事件(图1)。在进行基于质谱的蛋白质组学分析之前,Pehr Edman在1967年报道了一种蛋白质的测序技术(Edman降解法),但是最多只能测出30个氨基酸,每个残基大约需要一个小时。正是用这种技术,Wang等人对Aβ多肽的前28个残基进行了测序。几个研究小组使用20世纪60年代问世的商用质谱仪对寡肽的氨基酸进行排序并提供了理论证据。20世纪80年代末两种获得诺贝尔奖的软电离方法(基质辅助激光解吸/电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI) )发明出来前,质谱在蛋白质测序中的应用一直受限。MALDI早期是一种流行的电离技术,而ESI现在是复杂混合物中蛋白质组学分析的主导方法。这些技术的发展使蛋白质的高通量质谱分析成为可能。

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  图1 质谱和AD研究中的重大历史事件

  Edman降解也包括在内并重点介绍了AD蛋白质组学研究。该信息由几个在线资源(https://www.nature.com/collections/aajfehieag,https://www.hupo.org/Proteomics-Timeline,https://masspec.scripps.edu/learn/ms,https://www.alzforum.org/timeline,和https://www.alzheimers.net/history-of-alzheimers)以及参考文献汇编而成。质谱检测仪器包括扇形质谱、飞行时间法(TOF)、四极杆法、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、三重四极杆和轨道阱法。常用的电离方法包括大气压化学电离(APCI)、电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、解吸电喷雾电离(DESI)和实时直接分析(DART)。生物分子可以通过使用2μm树脂的纳米级液相色谱(LC)或多维蛋白质识别技术(MudPIT)进行分离以提高分辨率。MS前体离子可以通过碰撞诱导解离(CID)、电子俘获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)或高能碰撞解离(HCD)来碎裂。定量策略包括二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)、同位素编码亲和标记(ICAT)、细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(SILAC)、串联质量标记(TMT)、相对和绝对定量等压标记(ITRAQ)以及数据独立性采集(DIA)方法。选择/多反应监测(SRM/MRM)是一种用于分析预定义分子的质谱技术。数据库搜索工具包括SEQUEST、MASCOT和目标诱饵策略。CAA:大脑淀粉样血管病;LCM:激光捕获显微解剖;GWAS:全基因组关联研究;CSF:脑脊液;FDA:美国食品和药物管理局

  基于MS的蛋白质组分析通常由三个主要步骤组成(图2):(i)质谱前样本处理,(ii)MS数据采集,以及(iii)生物信息学;每一步都提供了各种各样的策略,以实现蛋白质鉴定和定量的最终分析目标。例如,人们可以选择自上而下或自下而上的策略,分别分析全长蛋白质或多肽(例如,胰蛋白酶消化的蛋白质)。由于蛋白质组内高度多样化的生化特性,在一个统一的条件下分析完整蛋白质的自上而下的方法是具有挑战性的。一项最全面的自上而下的研究从大约1000个人类基因中确定了3000多种蛋白质亚型。相比之下,自下而上的蛋白质组学依赖于对从完整蛋白质中酶解的多肽分析,使样本在生物化学上是同质的,从而将蛋白质组覆盖范围提高到10000多种蛋白质,尽管在将识别的多肽映射到蛋白质上存在差距。在自下而上的蛋白质组学中,水解的多肽通常用液相色谱(LC)分离,用ESI电离,然后用串联质谱(MS/MS或MS2)进行分析。等电聚焦也适用于肽的高分辨分离。应该注意的是,MS2本身是一种强大的分离工具,能够根据质量/电荷比(m/z)从其他共洗脱的多肽中选择指定的多肽。自下而上方法由于其灵敏度、吞吐量、稳健性和蛋白质组覆盖率等优点,被广泛应用于非靶向蛋白质组分析。

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  图2 蛋白质样品的质谱前处理、质谱数据采集和质谱后生物信息学数据处理

  蛋白质定量可以通过无标记方法,如光谱计数(SC)、提取离子流图(XIC)和数据独立性采集(DIA),或通过同位素标记方法,如SILAC和TMT来实现。此外,质谱还可通过多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM)分析目标蛋白/肽。

  目前人们有许多自下而上的蛋白质组学策略可用,可分为无标记和稳定同位素标记方法。无标记方法已经从半定量的光谱计数(通过指定的MS2光谱的总数来估计蛋白质的水平)发展到在MS1或MS2扫描中更精确地提取离子流图。稳定同位素标记方法始于化学蛋白质标记,如Cys-反应性ICAT,胺-反应性二甲基标记法,然后是代谢蛋白标记法(如SILAC),其中肽/蛋白的定量是通过混合样品中的差异标记的MS1峰来实现的。然而,混合谱图增加了MS1的复杂性,降低了肽的鉴定效率。为了克服这一限制,我们已经开发了等重肽标记方法,例如iTRAQ、TMT和Dileu,以产生等重MS1峰并实现多重标记(例如11-Plex、16-Plex、18-Plex和27-Plex TMT)。同位素峰碎裂后,释放不同的报告离子,以便在MS2/3扫描中进行相对定量。

  在MS数据采集期间,仪器在数据相关采集(DDA)模式或数据无关采集(DIA)的替代模式下运行。在DDA中,光谱仪利用MS1调查扫描在较小的分离窗口(例如0.5-2 m/z)中选择最丰富的肽离子(例如前10个),然后依次将其碎片化以生成MS2扫描。虽然这种方法效率极高,但DDA中的一些丰度较低的肽离子在容检测过程中易被遗漏。为了缓解采样不足的问题,DIA在整个质量范围内设置了连续的隔离窗口(例如10-50m/z),并不加区别地粉碎所有离子。然而,扫描所有DIA窗口会增加时间依赖性。因此,在快速扫描质谱仪出现之前,DIA的效率较低。关于质谱仪器,早期的分析人们使用了飞行时间(TOF)质谱仪,它们很容易与MALDI结合。后来,三重四极杆(QQQ)和线性离子阱因其成本效益而被推广为低分辨率质谱,而昂贵的傅立叶变换仪器(FTICR)则被用于高分辨率检测。如今,有了离子迁移率光谱(IMS)提供的离子分离能力,飞行时间(TOF)仪器得到了显著改进。此外, Orbitrap仪器的发明为基于MS的蛋白质组学带来了革命性的变化,它为蛋白质组图谱提供了一种强大而高分辨率的方法。

  质谱生物信息学工具从原始质谱数据中提取准确的信息,用于蛋白质鉴定和定量。它可以用计算程序搜索大型蛋白质数据库或MS谱库,以将MS2谱匹配给目标肽。人们在其他地方已经开发了大量的搜索算法。大规模蛋白质数据库搜索的一个问题是容易引入错误鉴定肽段,这已经通过引入目标-诱饵库搜索策略来解决,它能降低鉴定蛋白质的错误发现率(例如<1%)。在蛋白质鉴定之后,通常进行定量以评估样品中的蛋白质丰度,然后进行差异表达(DE)和网络分析以得出可检验的假说。

  总体而言,强大的自下而上的蛋白质组学方法需要MS前、MS中和MS后设置的无缝结合。鉴定出的蛋白质数量是评估蛋白质组技术必不可少的指标,因为关键的调节蛋白通常在细胞中以低丰度存在,这不是浅层蛋白质组分析所能检测到的。为了实现超深蛋白质组覆盖,目前研究中人们多数使用多路TMT标记结合蛋白质组学平台(例如TMT-LC/LC-MS/MS)、二维HPLC(例如碱性和酸性pH反相液相色谱)和高分辨率MS中的DDA(图3)。该平台最近产生了大量的深层AD蛋白质组数据。LC-IMS-DIA-MS是一个很有前途的无标记平台,它结合了离子迁移率光谱、一维LC和MS中与数据独立性采集,可以从脑组织中分析大约10000个蛋白质。除了质谱之外,人们还可以使用特定的亲和试剂来分析蛋白质,例如抗体(例如蛋白质芯片、ELISA和邻近延伸分析)和适配子(例如SOMAscan)。这些非质谱技术在处理大量样品时是有利的,但目前试剂可用性和特异性的缺陷阻碍了整个蛋白质组的覆盖。

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  图3 TMT-LC/LC-MS/MS的深层蛋白质组学工作流程

  TMT试剂用不同的颜色表示,它们与肽N末端和赖氨酸残基上的胺基发生反应。除胺反应基团外,等重TMT试剂还含有一个报告离子基团和一个平衡基团。报告基团中的质量差被平衡基团抵消,从而实现等重标记和合并。用LC/LC对合成的多肽进行分离,鉴定为混合的等重前体离子。在碎裂之后,TMT标签在报告基团和平衡基团之间被切割,产生用于定量的报告离子

  3. 对 AD 蛋白质组进行无偏分析

  不断发展的蛋白质组学技术研究了临床AD标本,以阐明该病在不同时期的潜在生物分子机制(图1)。在前基因组时代,不完整的蛋白质数据库将MS分析局限于已知的AD蛋白质(例如Aβ和tau)。LC-ESI-MS和MALDI-TOF-MS研究了淀粉样斑块的组成,鉴定了不同Aβ多肽的可溶性和不溶性。MS还鉴定出异常修饰的tau种类,包括磷酸化、乙酰化和脱酰胺化。随着2003年人类基因组计划的完成,第一个全面的人类蛋白质数据库问世,为大规模和公正的蛋白质组分析提供了基础;然而,蛋白质组学技术又花了十年的时间才开发出与人类蛋白质组深度相匹配的蛋白质组。

  对于分析整个蛋白质组的早期挑战,亚蛋白质组分析似乎是一种有效的策略。2004年,Liao等人提出通过激光捕获显微解剖(LCM)(一种解剖和分离感兴趣组织区域的技术)表征死后AD脑组织中的淀粉样斑块蛋白质组,通过捕获标记有硫黄素-S的淀粉样斑块进行蛋白质提取和MS分析,结果共鉴定出488种蛋白质。斑块组织与非斑块组织比较,斑块区域有26个DE蛋白富集。这项初步研究表明,淀粉样斑块中可能积聚了大量蛋白质。为简单起见,我们使用术语“淀粉样体”来表示淀粉样斑块中的所有生物分子。使用类似的方法,Drummond等人定量了AD亚型淀粉样体中的900多个蛋白质,报告了快速进展型AD和散发性AD的蛋白质差异。2019年,Xiong等人用LCM和目前的TMT-LC/LC-MS/MS方法对AD淀粉样体进行了更深入的重新分析,将蛋白质组覆盖范围增加到4000多个,其中包括40个高度富集在斑块区的DE蛋白质,APOE和补体蛋白。

  由于其低溶解度,AD样本的差异性生化提取提供了富集聚集蛋白组的另一种方法。2009年Gozal等人着手分析AD中的洗涤剂不溶性蛋白质组,即有序分离结合凝胶电泳和LC-MS/MS分析了512个蛋白质,其中11个蛋白质在AD样本中增加。2013年人们取得了重大进展,其中Bai等人报告了对大脑不溶性蛋白质组最全面的分析,涵盖了AD中的4216个蛋白质和36个DE蛋白质。正如预期的那样,最丰富的蛋白质是Aβ、tau、APOE和补体成分,以及与β剪接、磷酸化调节、突触可塑性和线粒体功能有关的蛋白质。令人惊讶的是,整个U1snRNP剪接复合物(例如U1-70K,U1A,U1C,U1snRNA和U1-70K切割片段)存在于不溶性蛋白质组中,并在散发性和家族性AD病例中形成一种新型的细胞质缠绕状原纤维。结合转录学揭示的伴随的RNA剪接缺陷,这些结果表明U1 snRNP病理及其相关的RNA剪接障碍在AD中存在。人们在细胞培养、苍蝇和老鼠模型中的进一步研究重将剪接缺陷与阿尔茨海默症的发病机制联系起来。

  在阿尔茨海默症中,突触丢失发生得较早,并且与认知障碍高度相关;因此,科研人员经常研究突触亚蛋白质组。突触后密度(PSD)是突触功能的一个整体结构,由神经递质受体、支架蛋白和其他调节成分组成的超分子复合物组成。Zhou等人采用超速离心和差异提取的方法从AD患者脑中分离PSD,并用无标记法分析了494个PSD组分。最近,两个小组利用先进的末端转移酶方法对突触亚蛋白质组中的~5000蛋白进行了定量。特别是,Carlyle等人分析了100个AD患者不同疾病阶段的大脑,发现认知障碍与显著的新陈代谢变化和炎症反应增加有关。

  除了亚蛋白质组研究,许多研究试图表征AD脑中的整个蛋白质组变化,人们分别使用2D Gel或自下而上的MS获得<1000和1408-6533个蛋白质。例如,Johnson等人对2000多个大脑进行了蛋白质组分析,其网络分析揭示了大量与AD相关的蛋白质模块,涉及突触/神经元、线粒体功能、糖代谢、细胞外基质、细胞骨架和RNA结合/剪接。这些研究还确定了富含神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的蛋白质模块。2015年,一种先进的LC/LC-MS/MS方法使AD大脑中的>10000蛋白质得以鉴定。人们将这种方法与TMT标记方法相结合,使深层蛋白质组谱分析变得可行。2020年Bai等人提出了这样一项研究,比较了五组死后脑组织中的14513种蛋白质:(i)低斑块和缠结的对照组,(ii)高度病理但没有认知障碍的对照组,(iii)轻度认知障碍(MCI),(iv)高度病理的AD,以及(v)仅有tau病理的进行性核上性麻痹(PSP)。这项研究鉴定了173个DE蛋白,与PSP病例相比其中绝大多数是AD特异性的。根据加权基因相关网络分析算法,DE蛋白可聚集成三种主要的共表达模式:(I)Aβ相关模式(从对照MCI到AD持续积累),(ii)tau相关模式(从对照到MCI稳定,但在AD中增加),以及(iii)与tau相反的模式(从对照到MCI稳定,但在AD中减少)。交互作用组学和通径分析揭示了17条改变的途径,包括Aβ、wnt、转化生长因子β/骨形态发生蛋白、G蛋白、整合素信号、先天免疫、获得性免疫、补体、细胞骨架和细胞外基质、铁稳态、膜转运、脂质代谢、蛋白质折叠和降解、突触功能、神经营养功能和线粒体功能。深入的AD蛋白质组学结果表明,在AD进展过程中存在广泛的、动态的蛋白质组扰动。

  到目前为止,三个独立的小组使用TMT-LC/LC-MS/MS平台从总共192个AD和对照皮质样本(图4)中产生了7个深层蛋白质组数据集(每个都鉴定>

  8000个蛋白质)。这些数据集为荟萃分析提供了一个极好的机会来增强统计能力,这些数据汇编成一个包含12017个独特基因产物的列表(每个基因对应一个蛋白质)。人们通过计算log2(AD/CONTROL)比值和相关的单尾p值,然后用Fisher方法和本杰米尼-霍奇伯格FDR校正进行p值组合,得到2698个DE蛋白(FDR<1%)。根据细胞类型特异性基因图谱,DE列表包含638个细胞类型特异性基因/蛋白,其中星形胶质细胞140个,神经元337个,少突胶质细胞10个,小胶质细胞118个,内皮细胞33个,这也侧面证明了不同细胞类型在AD发病机制中的作用。

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  图4 荟萃分析整合了7个深层AD数据集,鉴定出12017个蛋白质

  在每个数据集中,控制-AD比较的p值由单尾t检验得出。用Fisher法合并p值,然后用本杰米尼-霍奇伯格FDR程序进行多假设校正。总共有2698个DE蛋白被接受,FDR截止值为1%。与已报道的167个AD基因和危险位点相比,有35个与蛋白质DE列表重叠。根据细胞类型特异性基因,DE列表包含大脑中所有五种主要细胞类型特有的638个基因/蛋白质。

  4.AD蛋白质组学的功能观察

  除了概括已知的Aβ、tau和apoE在AD脑中的积累外,蛋白质组学图谱还显示了1484个上调的蛋白质和1214个下调的蛋白质(图4)。有趣的是,DE列表包含35个已报道的AD基因和危险位点,包括APP、MAPT、CLU、APOE、ICA1、PTK2B、CD2AP、SNX32、ADAM17、FERMT2、CARHSP1、ANK3、ABI3、PLEKHA1、BCKDK、GRN、COX7C、TMEM163、CNTNAP2、ADAMTS1、NDUFAF7、SEL1L、RTFDC1。沿着这一思路,人们报道了一项蛋白质组范围的关联研究(PWAS),将GWAS数据与脑蛋白质组学结果相结合,以确定11个导致AD的基因。蛋白质组-转录组比较表明,在AD中既有RNA依赖的表达变化,也有RNA非依赖的表达变化。值得注意的是,这些不依赖核糖核酸的DE蛋白通常与Aβ水平高度相关,并且富含淀粉样体,如MDK、PTn、NTN1、SmoC1、SFRP1、SLIT2、HTRA1和Flt1。通过对5xFAD小鼠(一种AD小鼠淀粉样变性模型)的互补蛋白质组和转录分析,验证了它们的RNA独立性。Mdk、ntn1和sfrp1也被证明与Aβ肽直接结合。淀粉样斑块的大小可达100 μm,这些斑块巨大的三维复杂性、不同的细胞结构和血管构筑可能会形成一个准细胞的“黑洞”,在其内部捕获大量的相关蛋白质,从而深刻影响蛋白质的周转。在淀粉样体的这些蛋白中,sFRP1(Wnt信号的调节者)被报道影响Aβ寡聚体的形成,因为sFRP1的抑制减少了斑块的形成,并部分挽救了AD小鼠模型(APP/PS1小鼠)的认知障碍,这佐证了它在AD发病机制中的作用

  AD的发展跨越了进行性神经退化之前的一个漫长的前驱阶段,这表明人类大脑对Aβ毒性的弹性机制,随后加剧的损害超过了弹性,并推动了不可逆转的退化,如平衡模型所示(图5)。在AD发病之前,一些已鉴定的DE蛋白可能起到保护作用,如Netrin-1、Netrin-3、中期因子、多核营养素、肝细胞生长因子和WNT5B,特别是在表现出高Aβ病理但没有临床症状的人类恢复力病例中。文献证据证实了这一评价,例如在脑室注射netrin-1的情况下,netrin-1改善了AD小鼠的工作记忆。Netrin受体UNC5C被鉴定为AD危险基因,另一个netrin家族成员NTN5位于GWAS的AD危险位点。中期因子和多营养素属于同一家族的轴突生长促进因子,它们与Aβ有高亲和力的直接相互作用,可能干扰Aβ的寡聚,降低其毒性。HGF信号的上调可能促进突触发生,从而补偿AD的突触丢失。此外,WNT途径被认为可以促进AD风险基因TREM2诱导的小胶质细胞的活性。

  

  图5 阿尔茨海默症进展过程中有害因素与保护因素的平衡模型

  在阿尔茨海默症(AD)无症状期激活的生物学过程和细胞通路中,有些可能起到保护作用。然而,随着疾病发展过程中损害的加剧,保护作用也就耗尽了。由此产生的失衡会导致神经元退化和临床症状的出现。途径信息是从目前的AD蛋白质组学研究中提取的。

  从MCI到AD的转变可能是由有害事件的上调和保护性事件的减少所诱导的,与tau病理的显著增加相一致的是,MCI向AD的转变可能是由于有害事件的上调和保护性事件的减少所致。DE列表包含大量的补体蛋白(C1QA、C1QB、C1QC、C1QL1、C1QTNF5、C1R、C1S、C3、C4a和C4b)。补体成分在阿尔茨海默症(AD)脑中聚集的亚蛋白组中显著升高。补体系统激活小胶质细胞来修剪AD中的突触。在大规模的GWAS分析中,补体基因CR1和C7被确定为AD的危险基因。在AD(APP/PS1)小鼠中删除C3被证明可以挽救突触丢失和记忆力下降。在肌萎缩侧索硬化症模型(PS19小鼠)中敲除C3aR(C3a受体)也可以减少炎症、突触缺陷和tau病理。因此,补体系统影响阿尔茨海默症进展过程中的多种分子和细胞事件。

  相反,许多神经营养因子在从MCI到AD的转变过程中减少,如VGF、BDNF、NRN1和CRH。值得注意的是,在蛋白质-蛋白质相互作用网络中,前四种神经营养因子围绕着BDNF中枢连接在一起。长期以来,BDNF一直被认为是与认知障碍、衰老和AD有关的一个组成部分。人们使用RIMBANET软件对AD多组学数据集进行多尺度因果网络分析,将VGF列为主要调节者。VGF在5xFAD小鼠体内的过表达减轻了病理变化,改善了记忆能力。NRN1可以促进轴突生长和突触成熟,在小鼠模型(Tg2576)中应用重组NRN1蛋白可以改善突触的可塑性。此外,AMPA型谷氨酸受体结合蛋白NPTX2在AD时明显降低。在阿尔茨海默症(APP/PS1)小鼠中,基因敲除会导致GluA4表达减少,神经元兴奋性增加。综上所述,这些关键蛋白的减少可能是阿尔茨海默症突触衰竭和认知功能障碍的病理生理机制之一。

  虽然我们使用一个简单的平衡模型来讨论识鉴定的DE蛋白在AD进展中的作用(图5),但这些AD相关蛋白的功能在长期的疾病发展过程中很有可能是多因素的,它们是发挥保护作用还是有害作用可能取决于时间、区域和细胞环境。

  5. 阿尔茨海默症中的翻译后修饰蛋白质组

  人体内的蛋白质功能受到无数翻译后修饰和动态蛋白质-蛋白质相互作用的严格调控。在表现为肌萎缩侧索硬化症的神经退行性疾病中,tau纤维在结构上的不同构象可用来划分疾病亚型。tau聚集与广泛的PTMS相关,包括磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、糖基化、叔丁基化、氧化和裂解。对这些疾病特异性tau构象的合理解释可能隐藏在PTM的领域中。Arakhamia等人利用MS和冷冻电子显微镜(Cryo-EM)将PTM映射到tau细丝的结构上,发现tau的泛素化可能有助于纤维多样性。最近人们从32例AD患者中提取了tau,并对其进行了质谱鉴定和蛋白质聚集活性的表征,研究发现其接种能力与T231、S235和S262位点的磷酸化显著相关。

  众所周知,tau乙酰化在tau病的早期和中期braak阶段升高,并可能减缓tau的降解。K280/K281位点的乙酰化可以促进tau的聚集。tau乙酰化状态受p300乙酰基转移酶和SIRT1去乙酰化酶调节。p300活性的化学抑制降低了tau的乙酰化水平,从而消除了与tau相关的病理,表明这可能是缓解 tau 病变的治疗策略。

  最近,Wesseling等人报道了通过一系列MS策略对AD大脑进行的最全面tau PTM分析。在42例对照组和49例AD患者的多个tau亚型上共鉴定出95个修饰事件(磷酸化55个,泛素化17个,乙酰化19个,甲基化4个)。使用Tau内标,他们还测量了一些PTM位点的化学计量比。PTM事件可能按顺序发生,并通过改变表面电荷来促进tau聚集和播种活性。AD患者tau PTM的这些图谱揭示了分子的异质性和疾病的分期。

  Bai等人采用磷酸肽富集和TMT-LC/LC-MS/MS相结合的方法,在AD患者不同时期的脑组织中鉴定出46612个磷酸肽(7083个蛋白中的34173个磷酸位点),揭示了398个蛋白中的873个DE磷酸肽。这项研究还在AD过度磷酸化的tau(56个磷酸化位点)和骨桥蛋白(SPP1)中发现了这两种蛋白,骨桥蛋白是免疫反应中的一种糖蛋白。有趣的是,IKAP算法用来从磷酸化蛋白质组中推导出186个激酶的活性,表明有28个不同的激酶活性,涵盖了所有已知的11个tau激酶。激酶活性和水平的整合共同表明AD中MAP激酶信号的激活。使用类似的方法,Ping等人报道了另一个独立的AD磷酸化蛋白质组的定量数据集(8415个蛋白质中的33652个磷酸位点)。磷酸化蛋白质组在AD发育过程中提供了另一层蛋白质组信息。

  此外,人们还报道了AD中蛋白质泛素化的全面分析,覆盖了1682个蛋白质中的4291个泛素化位点,其中800多个位点在AD中发生了变化。人们还发现特定的多泛素化链(Lys11、Lys48和Lys63)在阿尔茨海默病(AD)脑组织中积聚。这些数据表明了AD中泛素系统的失调。蛋白质N-糖基化是细胞中最普遍的PTM之一。Zhang等人对人脑中1132种蛋白质的2294个N-糖基化位点进行了分析,发现了178个与AD相关的N-糖基化位点变化,这表明蛋白质N-糖基化在疾病中发生了异常。综上所述,目前的质谱平台和富集策略可以对AD样本中的PTMS进行集中分析或蛋白质组分析。已经出现了大量的数据集,特别是在磷蛋白质组中。大量的PTM信息也可以在网上获得(www.philiosite.org),尽管这些数据并不是针对于AD的。综上所述,这些综合的PTM数据集对于研究AD发病过程中的生化信号通路将很有价值。

  6. 基于蛋白质组学的AD生物标志物发现

  基于MS的脑脊液蛋白质组学研究可用于发现生物标志物,目前已经取得了突破性进展。在许多蛋白质组学实验中,高丰度的蛋白质往往会掩盖低丰度的蛋白质,因此对这些丰度蛋白质进行免疫耗竭是提高低丰度蛋白质检测的常用方法。Sathe等人报道了5例对照组和5例AD患者的脑脊液深度研究,他们首先对脑脊液样本进行免疫去除,去除14种最丰富的蛋白质,然后用TMT-LC/LC-MS/MS方法进行分析。这项研究用139个DE蛋白定量了2327个蛋白,包括MAPT、NPTX2、VGF、GFAP、NCAM1、PKM和YWHAG。Higginbotham等人同时利用免疫去除技术提高了脑脊液蛋白质组的深度,并分析了20例对照组和20例AD患者的2875个蛋白质组,共发现528个DE蛋白,包括MAPT、NEFL、GAP43、FABP3、CHI3L1、NRGN、VGF、GDI1和SMOC1。

  Wang等人进行了广泛的LC分离以绕过免疫耗竭,并分析了5名对照组和8名AD患者中的5941种脑脊液蛋白,这显著增加了脑脊液蛋白质组的覆盖范围。这项研究产生了355个DE蛋白,其中SMOC1和TGFB2蛋白增加,而线粒体蛋白减少。Bader等人开发了一种先进的无标签平台,可以对来自三个大小相似的独立队列(总计109例对照和88例AD病例)的未耗尽脑脊液样本进行分析。这项研究分析了三个队列中的1445、1478和1483种蛋白质,突出了tau、SOD1和Park7这三种DE蛋白质,通过遗传数据也发现它们与神经退行性变有关。在所有上述研究中,这些结论至少部分得到了基于抗体检测、靶向MS方法或重复蛋白质组分析的验证实验的支持。

  人们对以上六个深层脑脊液数据集(每个>FDR 1000蛋白,总计260名AD和对照受试者)进行荟萃分析,得到了5939种蛋白质的列表,其中包括AD中311种上调的蛋白质和165种下调的蛋白质(图6)。为了加强特定脑脊液生物标志物的选择,整合脑脊液和脑蛋白质组是一种常用的策略。然后,我们将脑脊液中的这些DE蛋白与脑蛋白质组重叠,得到了65个上调的蛋白质(例如MAPT、SMOC1、HTRA1、PDLIM5、PRDX6、RUVBL2、CALB2、ARFGAP3、SPP1和DPCD)和44个AD下调的蛋白质(例如NPTX2、VGF、PDHA1、NDUFV1、NDUFA2、NDUFA12、NDUFA13)。荟萃分析为将来的验证提供了AD CSF蛋白质组资源。

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  图6 荟萃分析整合了6个深层脑脊液数据集,鉴定出5939个蛋白质

  使用图4中的相同方法计算出用于control-AD比较的单个和组合p值,然后进行FDR分析。在FDR临界值为1%的情况下,476个DE蛋白被接受,其中109个与AD脑组织中的DE蛋白列表重叠

  此外,Wang 等人比较了人类CSF和5xFAD小鼠CSF数据集,指出11种共享DE蛋白(例如SOD2、PRDX3、ALDH6A1、ETFB、HADHA和CYB5R3)可能由淀粉样变诱导。Higginbotham等人将脑脊液DE蛋白归纳为突触、血管、髓鞘、免疫和代谢,并应用五个生物标志物将无症状AD患者分为两个亚组。与AD相关病例的异质性一致,转录组学和脑脊液蛋白质组学涉及三种分子亚型。

  与脑脊液分析相比,AD血浆/血清样本的深度质谱分析较少,因为由于血脑屏障的原因,大脑中的分子变化可能不容易在血液中检测到。独特的血液成分动态范围也给分析带来了极大的挑战,从白蛋白(~50 mg/ml)到白细胞介素-6 (~4.2 pg/ml)。Dey等人报道了用薄层层析和LC/LC-MS/MS对5例对照组和6例AD患者的未耗尽血清进行超深度分析,鉴定出了4826种蛋白质,但仍然缺少丰度最低的蛋白质层(如A-β肽和tau)。然而,重叠的血清、脑脊液和皮质蛋白质组可鉴定出37个DE蛋白,其中包括22个线粒体蛋白,这表明AD患者的线粒体特征是一致的。

  细胞外小泡(EV)能够将脑蛋白输送到血液中,通过MS分析,这些蛋白可以作为另一类样本出现。EV是高度异质的纳米大小的脂泡,可释放到细胞外环境以进行细胞交流,它几乎可由任何类型的细胞分泌,包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。EV携带和传播AD相关蛋白,包括APP、Aβ肽和tau。从AD患者和小鼠模型的血浆、脑脊液和脑细胞分离的EV中,Aβ42/Aβ40比值、APP、Aβ单体和寡聚体、tau和tau磷酸化水平均有升高。随着越来越多的证据表明EV蛋白组分与AD的相关性,我们可以预见更全面的EV蛋白质组学分析用于AD生物标志物的发现。

  除了MS对潜在生物标志物的非靶向搜索外,针对脑脊液和血液中的已知病理标志物(例如Aβ和tau)的靶向试验一直在进行中并取得成功。例如,Aβ和磷酸化tau的脑脊液测试已经被国家老龄研究所和国际阿尔茨海默病新研究标准工作组接受。最近人们对位于T181、T217或T231残基的pTau进行脑脊液检测显示出很高的准确性。这些分析已经进一步扩展到血液测试。基于MS的Aβ多肽(即PreciityAD™)血液检测试剂盒已经上市,人们还开发了有针对性的质谱方法来评估脑脊液和血液中T217和T181残留处的pTau水平。pTau数据与淀粉样蛋白和tau蛋白的PET成像分析以及AD的临床分期相一致。尽管pTau分析前景看好,但它在血液中的浓度极低(<1pg/ml),需要抗体亲和富集或基于抗体的高灵敏度simoA试剂盒。人们需要进一步的独立和大规模试验来评估pTau生物标志物的灵敏度和特异性。

  7. 基于AD蛋白质组学的系统生物学研究结论与展望

  在系统生物学中,生物表型和疾病表型被认为是由空间和时间维度上的成分调节的新兴特性,它们的相互作用在结构、分子、细胞

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